枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶抗烟草花叶病毒活性及其酶学性质的初步研究

摘要

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是指在pH为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类，是一种广谱性的蛋白水解酶，且来源广泛。由微生物法获得碱性蛋白酶成本低、产量高，方法科学可行。本研究旨在利用碱性蛋白酶降解烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白从而达到防治烟草花叶病的目的，为植物病毒病的防治提供一条崭新而有效的途径。论文从产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选、碱性蛋白酶的分离纯化、碱性蛋白酶抗TMV活性及其酶学性质等方面进行研究，主要研究结果如下： (1)从实验室已保存的4株枯草芽孢杆菌中，筛选出一株产高活性碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌W-QX-1。 (2)对菌株的发酵条件进行了研究，分别试验了起始pH和装液量对发酵产酶的影响，绘制了发酵过程曲线。确定其最适发酵条件为：发酵起始pH为8.0，装液量为20mL/250mL，发酵周期为36h。 (3)菌株W-QX-1的发酵液经硫酸铵盐析、透析及非变性电泳分离得到纯的碱性蛋白酶，SDS-PAGE测得其相对分子质量为42400。 (4)采用半叶枯斑法在心叶烟上检测W-QX-1碱性蛋白酶抗TMV活性，发现该酶对TMV具有明显的体外钝化作用，酶液浓度为20mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L时，其钝化效果分别达到45.20％、53.40％、60.42％和76.73％1该酶对TMV的初侵染和体内复制增殖具有一定的抑制能力，实验结果表明在TMV侵染前24h施用浓度为200mg/L碱性蛋白酶液抑制其侵染力的效果达到50.35％，而在TMV侵染后施用也具有一定的抑制其复制增殖的作用，但效果并不明显。 (5)以酪蛋白为底物，对菌株W-QX-1产碱性蛋白酶酶学性质进行了研究。该酶的最适作用温度为50℃左右，在硼酸一硼砂缓冲液中的最适作用pH为7.8，在Tris-HCl缓冲液中的最适作用pH为8.0，在pH6～10范围内，45℃以下酶的稳定性较好。Ca2+、K+、Mg2+对酶都有一定的激活作用，而Cu2+、Ag+则能抑制酶活；EDTA对该酶显示出较强的抑制作用，而SDS对该酶有明显的激活作用。 (6)枯草芽孢杆菌W-Qx+1产碱性蛋白酶可以降解多种蛋白底物，其中对干酪素的降解能力最强，对可溶性丝素、明胶、牛血清白蛋白和精炼丝素也均有不同程度的降解，是一种广谱性的蛋白水解酶。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1烟草花叶病毒的研究现状

1.1.1烟草花叶病毒病在我国的发生及为害情况

1.1.2抗烟草花叶病毒物质的种类

1.1.3抗烟草花叶病毒物质的作用机理

1.2微生物碱性蛋白酶的研究进展

1.2.1碱性蛋白酶的结构类型

1.2.2碱性蛋白酶的性质

1.2.3微生物碱性蛋白酶的产生菌

1.2.4微生物碱性蛋白酶的应用

1.2.5碱性蛋白酶活性的测定方法

1.3本研究的提出及论文设计思路

第二章材料与方法

2.1供试材料

2.1.1供试菌株

2.1.2常用培养基

2.1.3供试植物

2.1.4供试毒源

2.1.5主要仪器及试剂

2.2试验方法

2.2.1分析方法

2.2.2碱性蛋白酶产生菌的筛选

2.2.3产酶发酵条件优化

2.2.4碱性蛋白酶的分离纯化

2.2.5碱性蛋白酶抗烟草花叶病毒室内生物活性测定

2.2.6碱性蛋白酶酶学性质研究方法

2.2.7碱性蛋白酶对各种天然蛋白质的降解

第三章结果与分析

3.1蛋白酶产生菌的筛选

3.1.1产蛋白酶枯草芽孢杆菌的初筛

3.1.2产蛋白酶枯草芽孢杆菌的复筛

3.2产酶发酵条件优化

3.2.1不同起始pH值对菌株发酵产酶的影响

3.2.2不同装液量对菌株发酵产酶的影响

3.2.3产酶曲线的测定

3.3蛋白酶的分离纯化

3.3.1盐析

3.3.2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

3.3.3碱性蛋白酶相对分子量测定结果

3.4碱性蛋白酶抗烟草花叶病毒活性测定结果

3.4.1碱性蛋白酶对TMV体外钝化作用的测定结果

3.4.2碱性蛋白酶抑制TMV初侵染作用的测定结果

3.4.3碱性蛋白酶抑制TMV复制增殖作用的测定结果

3.5碱性蛋白酶酶学性质测定结果

3.5.1酶作用的最适温度

3.5.2酶的热稳定性

3.5.3酶作用的最适pH

3.5.4酶的酸碱稳定性

3.5.5金属离子和添加剂对碱性蛋白酶活性的影响

3.6碱性蛋白酶对各种天然蛋白质的水解情况

第四章讨论

4.1培养基和发酵条件的选择对菌株产酶的影响

4.2关于碱性蛋白酶分离纯化的初步研究

4.3关于碱性蛋白酶抗TMV活性的研究

4.3.1室内生物测定方法对碱性蛋白酶抗病毒活性的影响

4.3.2 W-QX-1碱性蛋白酶具备可开发为烟草花叶病毒抑制剂的潜力

4.4关于碱性蛋白酶稳定性的研究

4.5金属离子和添加剂对碱性蛋白酶活性的影响

4.6 W-QX-1碱性蛋白酶的开发应用前景

第五章结论

参考文献

致谢

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