小麦叶绿体信号识别颗粒54和G蛋白的全长cDNA克隆及生物信息学分析

摘要

小麦条锈病属于世界性病害。目前，人们对小麦与条锈菌互作机理的研究主要集中在细胞学和组织病理学等方面，分子生物学方面的研究则相对较少。本实验室在前期的工作中，构建了受条锈菌生理小种CY23侵染的小麦品种水源11的抑制性差减杂交文库。对文库中包含的2，606个阳性克隆全部提取质粒后测序，共得到2，167条高质的ESTs。 本研究在以抑制性差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization)获得大量受小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp．triici)诱导差异表达基因的基础上，从中挑选了一个与类囊体膜蛋白运输相关基因和一个酪氨酸磷酸化蛋白A(tyrosine phosphorylated protein A，TypA)型G蛋白基因，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆全长，并对目的基因进行了初步的生物信息学分析和转录水平的表达谱分析，旨为进一步揭示小麦与条锈菌互作过程中的分子及其功能奠定理论基础。 采用RACE技术克隆了一个cpSRP54蛋白基因，命名为TAFFC。序列分析表明，该基因全长1727bp，包含一个完整开放阅读框，长为1446bp，编码481个氨基酸，包含3个保守结构域。该基因编码蛋白与水稻、豌豆、拟南芥、葡萄等多种植物的叶绿体信号识别颗粒54高度同源，其中与水稻的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明，该基因在受到条锈菌诱导下，在亲和组合中表达趋势明显下调，而在非亲合组合中的表达趋势比较稳定。推测条锈菌侵染小麦后，影响了叶绿体蛋白的运输，进而影响了小麦的光合作用。 采用RACE技术克隆了一个酪氨酸磷酸化蛋白A(tyrosine phosphorylated protein A，TypA)型G蛋白基因，命名为TATYPA。该基因全长2512bp，具有编码生成一个675个氨基酸的完整阅读框，包含4个结构域。进化树分析表明，TATYPA与水稻、毛果杨、红车轴草、盐地碱蓬、葡萄、拟南芥等多种植物的酪氨酸磷酸化蛋白A高度同源，其中与水稻的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示，该基因在亲和组合中的表达趋势比较稳定，非亲合组合中的表达趋势在24h以前呈下调趋势，24h以后表达量呈上调趋势。TypA型G蛋白在植物体中作为活性氧胁迫的调节基因，推测TATYPA可能通过控制活性氧积累，参与小麦与条锈菌互作的抗病过程中。

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论文说明：缩略词

声明

第一章文献综述

1.1小麦条锈病

1.1.1小麦条锈病的历史、分布及危害

1.1.2小麦条锈病分子生物学研究

1.2植物抗病的生物化学及分子生物学研究

1.2.1小麦抗条锈病生化机理研究现状

1.2.2植物抗病基因的克隆与分离方法

1.3小麦与条锈菌互作的研究趋势

1.4 TAFFC基因研究进展

1.4.1 cpSRP介导的蛋白识别转运途径

1.4.2拟南芥突变体中cpSRP缺失的功能研究

1.5 TATYPA相关基因研究进展

1.5.1植物G蛋白与植物防卫反应

1.5.2 G蛋白TypA/BipA的研究进展

1.6 cDNA末端快速扩增技术(RACE)

1.7生物信息学

1.7.1生物信息学的产生和发展

1.7.2生物信息学在基因克隆及序列分析中的应用

1.8实时荧光定量PCR技术

1.8.1 PCR技术从定性到定量的飞跃

1.8.2实时荧光定量PCR技术原理

1.8.3荧光化学

1.8.4定量方法

1.8.5荧光定量PCR技术在植物上的应用

1.9实验设计

1.9.1立题依据、研究目的及意义

1.9.2技术路线

第二章小麦cpSRP54蛋白基因TAFFC的全长cDNA克隆及生物信息学分析

2.1材料、试剂及仪器

2.1.1材料

2.1.2试剂

2.1.3仪器

2.2实验方法

2.2.1 RACE引物设计

2.2.2总RNA提取

2.2.3总RNA纯化

2.2.4总RNA浓度、纯度及完整性检测

2.2.5一链cDNA合成

2.2.6 PCR扩增

2.2.7 PCR扩增产物凝胶回收

2.2.8 PCR产物与载体连接

2.2.9感受态细胞的制备及连接产物的转化

2.2.10重组质粒的筛选与鉴定

2.2.11测序

2.2.12序列分析整理

2.2.13序列拼接及全长引物设计

2.2.14 RT-PCR克隆验证

2.2.15生物信息学分析

2.2.16实时荧光定量RT-PCR

2.3结果与分析

2.3.1 3'-RACE和5'-RACE

2.3.2 TAFFC全长cDNA序列

2.3.3 ORF查找及推测的氨基酸序列

2.3.4相似性和同源性搜索

2.3.5氨基酸一级结构的预测

2.3.6氨基酸二级结构的预测

2.3.7多肽跨膜区域

2.3.8蛋白功能位点分析预测

2.3.9进化树分析

2.3.10实时荧光定量PCR

2.4讨论与结论

2.4.1讨论

2.4.2结论

第三章小麦G蛋白基因TATYPA的全长cDNA克隆及生物信息学分析

3.1材料、试剂及仪器

3.1.1材料

3.1.2试剂

3.1.3仪器

3.2实验方法

3.2.1基因克隆

3.2.2生物信息学分析

3.2.3实时荧光定量PCR

3.3结果与分析

3.3.1 3'-RACE和5'-RACE序列拼接

3.3.2 ORF查找及推测的氨基酸序列

3.3.3相似性和同源性搜索

3.3.4氨基酸一级结构的预测

3.3.5氨基酸二级结构的预测

3.3.6多肽跨膜区域

3.3.7蛋白功能位点分析预测

3.3.8进化树分析

3.3.9实时荧光定量PCR

3.4讨论与结论

3.4.1讨论

3.4.2结论

小结

参考文献

致谢

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