褪黑素对猪卵泡发育与闭锁的影响研究

摘要

卵泡是哺乳动物卵巢的基本结构与功能单元，哺乳动物卵巢内存在大量处于不同发育阶段的卵泡，但是大部分卵泡在发育的不同阶段会发生退化和闭锁，只有少数才能发育成熟以致排卵。卵泡的发育与闭锁是一个受内分泌、旁分泌及基因调节的复杂生理过程，研究猪卵泡的发育与闭锁对更好地理解母猪的生殖机理及进一步提高母猪繁殖力均具有重要的理论价值和现实意义。褪黑素主要是由哺乳动物松果体产生的一种吲哚胺类激素，是联系机体神经系统和免疫系统的重要因子之一。研究发现，褪黑素具有较强的氧自由基清除功能，对人类、猪、牛、绵羊、大鼠、小鼠等物种的生殖机能具有调控作用。然而，有关褪黑素对猪卵泡闭锁的影响研究目前尚无系统报道。本研究探讨褪黑素受体基因在母猪不同组织中的表达规律，揭示猪不同程度闭锁有腔卵泡中褪黑素的含量水平，解析内源性褪黑素水平与卵泡闭锁的相关性，并进一步以猪健康有腔卵泡和颗粒细胞为体外培养模型，探讨不同水平褪黑素处理对体外培养猪有腔卵泡发育潜能的影响，以及褪黑素影响颗粒细胞凋亡与类固醇生成的作用途径，为进一步认识褪黑素对猪卵泡发育与闭锁的影响及其分子调控机制提供新的依据。本研究获得如下结果:
　　1.成年母猪的脑、肝脏、胰脏、脂肪、卵巢、肾脏、心脏和脾脏等组织中均存在褪黑素受体基因MT1和MT2表达，猪卵巢和脑组织中MT1和MT2的mRNA表达均显著高于其它组织(P＜0.05)。
　　2.褪黑素在猪有腔卵泡中的含量分布呈显著差异(P＜0.05)，健康卵泡中褪黑素水平最高，早期闭锁卵泡中次之，晚期闭锁卵泡中最低。不同程度闭锁卵泡中颗粒细胞的凋亡率顺序为:晚期闭锁卵泡＞早期闭锁卵泡＞健康卵泡。卵泡内褪黑素水平与颗粒细胞凋亡率的皮尔逊相关系数为-0.847，褪黑素水平与卵泡闭锁存在强的负相关性。健康卵泡颗粒细胞中褪黑素受体MT1和MT2表达显著高于闭锁卵泡(P＜0.05)，褪黑素及其受体可能在猪卵泡发育与闭锁调控中发挥重要作用。
　　3.体外培养直径3～5 mm的猪健康有腔卵泡，添加不同浓度褪黑素(0，0.05，0.2，0.8 ng/mL)处理6d，检测褪黑素对体外培养猪有腔卵泡发育潜能的影响。结果揭示，培养48 h后，0.05，0.2和0.8 ng/mL褪黑素处理均提高了卵丘颗粒细胞层数，其中添加0.8 ng/mL褪黑素组A级COCs比率(17/48)最高。培养6d后，褪黑素各处理均显著提高了卵泡的存活率及卵泡膜完整率，添加0.2 ng/mL褪黑素组卵泡存活率达95.83％，膜完整性达72.22％。培养3d后，0.05 ng/mL褪黑素处理有腔卵泡获取的卵母细胞卵丘扩散率达到88.89％，0.2 ng/mL褪黑素处理卵母细胞极体排出率达56.94％，显著高于对照组(P＜0.05)。培养3d后，褪黑素各处理均显著降低了体外培养有腔卵泡中颗粒细胞的凋亡率(P＜0.05)。表明添加0.05，0.2及0.8 ng/mL褪黑素对体外培养有腔卵泡的存活、卵丘增殖、卵泡膜完整性维持等均具有促进作用，并且能够显著抑制颗粒细胞凋亡。
　　4.分离3～5 mm健康卵泡的颗粒细胞，添加不同水平褪黑素(0，0.001，0.01，0.1，1.0，10 ng/mL)体外培养48 h后，检测褪黑素处理对体外培养颗粒细胞增殖凋亡及类固醇生成的影响。结果表明，添加0.01 ng/mL褪黑素能够显著促进体外培养颗粒细胞的增殖活力及集落形成(P＜0.01)，刺激体外培养颗粒细胞的E2分泌(P＜0.05)，下调P4水平(P＜0.05)，上调类固醇合成酶CYP17A和CYP19A的表达(P＜0.05)，抑制颗粒细胞凋亡(P＜0.05)。采用0.01 ng/mL褪黑素(MT)或MT联用其受体激动剂与拮抗剂（（MT+IIK-7，MT+Luzindole，MT+4P-PDOT）处理体外培养颗粒细胞，检测发现，MT及MT+IIK-7处理均能显著抑制颗粒细胞凋亡(P＜0.05)，并上调MT2、Bcl-2、SOD1及GPX4的表达(P＜0.05)，降低Bax、P53和Caspase-3的表达(P＜0.05);与MT处理相比，MT+Luzindole及MT+4P-PDOT处理组颗粒细胞的凋亡率则明显上升(P＜0.05)，MT单独处理引起的相关基因表达变化也被阻断或消减(P＜0.05)。表明褪黑素可通过MT2受体激活方式上调体外培养颗粒细胞中Bcl-2、GPX4和SOD1表达，下调Caspase-3、P53和Bax表达，从而抑制颗粒细胞凋亡。
　　5.体外无血清或内质网应激诱导条件培养猪卵巢颗粒细胞，添加不同水平褪黑素(0，0.001，0.01，0.1，1.0，10 ng/mL)处理24 h，检测褪黑素处理对颗粒细胞增殖与凋亡的作用。结果证明，1.0 ng/mL褪黑素处理显著抑制了由血清剥夺诱发的颗粒细胞凋亡(P＜0.05)，而Luzindole具有抵消褪黑素抗凋亡效应的作用(P＜0.05)。与衣霉素Tun阳性处理、血清剥夺处理及空白对照相比，1.0 ng/mL褪黑素处理及血清剥夺后添加1.0 ng/mL褪黑素处理均显著抑制了颗粒细胞凋亡(P＜0.05)。各处理对体外培养颗粒细胞中MT1和FAS表达无明显影响(P＞0.05)。与空白对照组及MT+Luzindole组相比较，1.0 ng/mL褪黑素处理显著上调了MT2表达(P＜0.05),抑制了FASL、CHOP和GRP78的表达(P＜0.05);与对照组相比较，含1.0 ng/mL褪黑素各组SOD1和GPX4表达水平均显著升高(P＜0.05)。褪黑素可通过其受体激活途径调控FAS、FSA L、 CHOP、GRP78、SOD1和GPX4基因的表达，从而有效抑制体外培养颗粒细胞的凋亡。
　　综上所述，猪卵泡中褪黑素水平与卵泡闭锁程度紧密相关，添加适宜水平褪黑素可促进体外培养有腔卵泡的生长发育，并能抑制体外培养颗粒细胞的凋亡，调节颗粒细胞类固醇分泌，有差别地调控死亡受体、内质网应激应答因子及抗氧化酶基因等的表达。褪黑素可能是通过其直接清除自由基功能发挥作用的，但同时也通过膜受体激活途径发挥其调控作用。本研究对进一步认识猪卵泡发育机理研究提供新的理论依据。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1．1 哺乳动物的卵泡发育模式

1．2 哺乳动物卵泡发育的调控机制

1．3 卵泡闭锁调控机制研究进展

第二章 褪黑素的功能及其对雌性生殖调控的研究进展

2．1 褪黑素的发现及其理化性质简介

2．2 褪黑素的生物合成、分泌和代谢

2．3 褪黑素与疾病及其生物学功能

2．4 褪黑素受体及其信号通路

2．5 褪黑素在哺乳动物生殖与生理调控中的研究进展

2．6 本研究的目的与意义

第二部分 试验研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 褪黑素及其受体在猪卵泡中的分布与表达

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 结果与分析

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 褪黑素对猪卵巢有腔卵泡体外发育潜能的影响

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．3 结果与分析

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 褪黑素对体外培养颗粒细胞凋亡及类固醇生成的作用

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．3 结果与分析

6．4 讨论

6．5 小结

第七章 褪黑素对体外应激条件下颗粒细胞凋亡的影响

7．1 前言

7．2 材料与方法

7．3 结果与分析

7．4 讨论

7．5 小结

结论

创新点

参考文献

附录

缩略语

致谢

作者简介