CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的多基因敲除滩羊的制备与评价

摘要

借助于高通量测序技术、GWAS等组学分析技术，挖掘与家畜优良经济性状及抗逆性状相关的功能基因，进而在常规育种方法技术的基础上，利用分子育种技术，加快育种进程，提高家畜育种水平，变得愈来愈具有可能。特别是近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展与应用，使得育种者在家畜基因组上定点、精确、高效地进行特定基因的精准编辑，从而使得动物的表型向着人们期望的目标变化成为现实。同时，有可能实现多个基因的同时定点精准编辑，在表型上实现聚合效应，缩短育种周期，提高育种效果。本研究在细胞水平、胚胎水平首先分别验证了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基因敲除效率，之后，通过将Cas9mRNA与6条分别针对MSTN、ASIP和BCO2三个基因CDS区的靶向sgRNA同时注射到1细胞期受精卵的胞质中，经体外培养与胚胎移植，成功获得了多基因敲除滩羊，并对基因敲除羊的敲除情况、脱靶效应、遗传性以及表型进行了系统分析。主要研究结果如下:
　　1.成纤维细胞上的编辑效率验证。分别针对每个基因的CDS区设计两个sgRNA，构建细胞表达载体，与Cas9细胞表达载体共同转染成纤维细胞。对比单sgRNA敲除策略和双sgRNA敲除策略的编辑效果,发现双sgRNA敲除策略可以产生更多的突变基因型和更大的片段缺先可以使MSTN、ASIP、BCO2三个基因的敲除效率维持在50％-80％之间。与此同时，设计的所有sgRNA均未检测到脱靶效应。
　　2.胚胎上的编辑效率验证。分别构建每条sgRNA的体外表达载体体外转录出Cas9mRNA和sgRNA，将Cas9mRNA与6条sgRNA通过胞质共注射的方法注入1细胞期受精卵，每两条sgRNA靶向同一个基因CDS区上的位点。MSTN、ASIP、BCO2三个基因单独的敲除效率分别为35％、50％、50％，同时被敲除的效率为20％。
　　3.基因敲除滩羊的构建。同期发情处理36只供体滩羊，收集到613枚受精卵，利用胞质注射的方法注射了588枚1细胞期受精卵，经体外培养至4-6细胞期，将其移植至82只受体母羊体内，获得了54只羔羊，存活36只，26只活羔被成功编辑，有2只羔羊同时敲除了MSTN、ASIP、BCO2三个基因。
　　4.基因敲除滩羊各组织编辑情况检测。通过采集基因敲除滩羊八种由三个胚层分化而来的组织（心、肝、脾、肺、肾、皮肤、肌肉、睾丸）检测基因编辑情况，发现所有组织均被成功编辑，说明采用的基因敲除方法可以用来构建全身敲除性滩羊。此外，采集MSTN基因敲除滩羊的肌肉组织，ASIP基因敲除滩羊的皮肤组织，BCO2基因敲除滩羊的脂肪组织，进行敲除情况检测，发现三种基因在各自主要发挥功能的组织中均发生了基因突变。
　　5.基因敲除滩羊遗传性检测。利用H&E染色方法检测基因编辑阳性滩羊的睾丸组织，结果发现基因敲除滩羊睾丸组织中存在活性生殖细胞。之后利用体视镜分离生殖细胞并检测其基因编辑情况，结果表明基因敲除滩羊的生殖细胞中均含有基因突变。以上说明，构建的基因敲除滩羊可以产生具有活性的含有突变基因型的生殖细胞，即经基因编辑产生的基因突变具有遗传潜力。
　　6.BCO2基因敲除滩羊的表型分析。本试验根据是否含有野生基因型将基因敲除滩羊分为双等位基因敲除组和单等位基因敲除组，利用RGB颜色标准来鉴定滩羊脂肪颜色，并利用蛋白免疫印迹技术比较这两组基因敲除滩羊与野生型滩羊BCO2蛋白的表达差异，结果表明只有双等位基因敲除滩羊不能表达BCO2蛋白，揭示了BCO2基因只有发生双等位基因突变，才会导致蛋白表达的缺失，从而引起黄色脂肪的发生。
　　7.MSTN基因敲除滩羊的表型分析。通过连续监测MSTN基因敲除滩羊0-240d的体重变化情况，发现MSTN基因敲除滩羊的初生重以及平均日增重显著高于野生型对照组(P＜0.05)，且在D0-D30、D150-D240这两个阶段，MSTN基因敲除滩羊的体重要显著高于野生型对照组(P＜0.05)。进一步利用H&E染色及透射电子显微镜等形态学方法观察MSTN基因敲除滩羊肌肉组织的形态差异，发现MSTN基因敲除滩羊的肌肉纤维细度显著大于野生型滩羊。又通过蛋白免疫印迹的方法来分析MSTN基因敲除滩羊MSTN蛋白的表达情况，结果表明MSTN基因敲除滩羊下调了MSTN蛋白的表达水平。
　　综上所述，本研究利用基因精准编辑技术成功制备了MSTN、ASIP、BCO2等单基因或多基因敲除滩羊，建立了一套由CRISPR/Cas9技术介导的可以在滩羊上同时定点编辑多个基因的技术方法，为多基因聚合滩羊新品种（品系）奠定了技术基础，同时提供了新的育种材料。