雌激素膜受体GPR30对山羊卵母细胞成熟过程中卵丘扩展的影响及其机制研究

摘要

卵丘细胞是一种高度特异性的细胞，围绕在有腔卵泡卵母细胞以及早期胚胎的周围。卵丘细胞与卵母细胞之间的联系对卵母细胞的发育和成熟有着重要的作用。研究显示卵丘扩展是卵母细胞成熟的首要形态学指标并且高剂量的雌激素可明显促进卵丘细胞的扩展。雌激素核受体的两种亚型ERα和ERβ广泛分布在多种组织和细胞中，介导了雌激素的大部分作用，但是雌激素也可以快速调控细胞内的事件，如cAMP的产生，Ca2+的迁移等，这些快速的雌激素效应并不涉及某些细胞中的转录活化，而是直接作用于细胞的表面。Filardo等发现了一种雌激素的膜受体G蛋白偶联受体30(Gprotein-coupled receptor30，GPR30)，研究显示GPR30可以在某些条件下快速介导上述雌激素事件。虽然GPR30在许多细胞和组织中扮演着重要的作用，但是在山羊卵丘细胞和卵母细胞中是否也存在GPR30的表达，目前还没有被报道出来。因而本研究首先检测了体外培养山羊卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocytes complexes，COCs）24 h前后，GPR30的表达和定位。在确定GPR30存在于山羊COCs中的基础上使用G1和G15进一步研究了GPR30在山羊卵母细胞成熟过程中对卵丘扩展的影响，并研究了GPR30介导的雌激素信号通路在山羊成熟培养过程中对卵丘扩展的作用机制。其研究内容和结果如下:
　　(1)利用免疫荧光的方法，检测了体外成熟培养24 h前后的山羊COCs中GPR30的定位与表达，结果显示，在山羊卵丘细胞与卵母细胞上都存在GPR30的表达，并且定位在细胞质膜上。另外，qRT-PCR和Western Blotting的结果显示，体外成熟培养山羊COCs24 h前后，都有GPR30 mRNA和蛋白的表达，并且在体外培养24h后，COCs与卵丘细胞中GPR30 mRNA和蛋白表达水平都明显较培养前高(P＜0.05)，成熟卵母细胞中GPR30 mRNA和蛋白的表达水平显著比成熟培养前低(P＜0.05)。
　　(2)在上述研究的基础上，首先利用雌激素的特异性激动剂G1和特异性抑制剂G15研究了是否GPR30介导了雌激素对卵母细胞成熟的影响。体外成熟培养24 h后的山羊COCs，依照卵母细胞中第一极体的排出情况，统计17β-E2组、对照组、G1组和17β-E2与G15共同处理组中卵母细胞的成熟率。结果显示，17β-E2组较对照组显著促进了山羊卵母细胞的成熟（P＜0.05），G1组也明显较对照组中的成熟卵母细胞数量多(P＜0.05)，虽然G1组的成熟率低于17β-E2组的成熟率，但是两组之间并没有显著的差别(P＞0.05)，表明G1可以在一定程度上模仿17β-E2对卵母细胞成熟的促进效应。而G15与17β-E2共同处理COCs24 h后，卵母细胞的成熟率明显较17β-E2组和G1组低(P＜0.05)，但是较对照组却显著增加了成熟卵母细胞的数量（P＜0.05），表明山羊卵母细胞的成熟受到了GPR30介导的雌激素信号通路的调控，至少部分由GPR30介导。
　　(3)为了研究雌激素的膜受体GPR30介导的雌激素信号通路在山羊卵母细胞成熟过程中对卵丘扩展的影响，将体外培养24 h后的山羊COCs，根据Vanderhyden等(1990)文献中报道的卵丘扩展分级和扩展指数的评估方法，分别统计不同处理组和对照组中的卵丘细胞的扩展指数。结果显示，与对照组相比，17β-E2单独处理能够明显增加山羊卵丘细胞的扩展指数(P＜0.05)，并且G1也能够增加山羊卵丘细胞扩展指数，另外17β-E2与G15联合处理COCs24 h后，卵丘细胞的扩展指数比对照组高，但是两组之间没有明显的差异(P＞0.05)，而与17β-E2组和G1组相比，却降低了卵丘细胞的扩展指数。另外在体外培养山羊COCs24 h后，研究了上述各组中与卵丘扩展有关基因（HAS2，PTGS2，PTX3，TNFAIP6）的相对表达水平，qRT-PCR的结果显示，17β-E2组和G1组较对照组明显增加了卵丘细胞中HAS2和PTX3 mRNA的表达水平（P＜0.05），但是PTGS2和TNFAIP6mRNA的表达水平在17β-E2组、G1组和17β-E2和G15共同处理组中没有明显的差异(P＞0.05)。
　　(4)为了进一步探讨GPR30介导的雌激素信号通路对山羊卵母细胞成熟过程中卵丘扩展的作用机制，采用ELISA的方法测定山羊COCs中的cAMP水平，结果显示，17β-E2组能够明显较对照组增加山羊COCs中cAMP水平，G1组也能够较对照组明显增加cAMP的水平(P＜0.05)，进一步表明雌激素与GPR30结合促进了COCs中cAMP的产生。然而17β-E2组与G1组相比，有着明显的差异，G15处理山羊COCs2 h后也明显较对照组中的cAMP水平高，但与17β-E2组和G1组相比较却明显低于上述两组山羊COCs中的cAMP水平(P＜0.05)。另外根据之前的研究显示ERK1/2可以促进卵丘细胞的扩展，推测雌激素可能通过影响ERK1/2的磷酸化水平促进卵丘的扩展。因此将山羊COCs分别在对照组（未添加17β-E2）、G1(100nM)组、17β-E2（1μg/mL）+G15(100nM)组和17β-E2(1μg/mL)组中培养30 min，探究了GPR30介导的雌激素信号通路对山羊COCs中ERK1/2的磷酸化水平的影响，蛋白质免疫印迹的检测结果显示，17β-E2和G1分别单独处理COCs30 min时明显较对照组中的ERK1/2的磷酸化水平高，但G1组ERK1/2的磷酸化水平与17β-E2组ERK1/2的磷酸化水平相比却有显著的差异(P＜0.05)。然而G15的添加却明显降低了17β-E2对ERK1/2磷酸化水平的促进作用，而且G15与17β-E2共同处理组中的ERK1/2磷酸化水平依然显著比对照组高(P＜0.05)，表明GPR30介导的17β-E2通过调控ERK1/2的磷酸化水平促进了山羊卵丘细胞的扩展。
　　综上所述，在体外培养24 h前后的山羊COCs中，卵丘细胞与卵母细胞上都存在GPR30的表达，且定位在细胞的质膜上。GPR30介导了17β-E2(1μg/mL)对山羊卵母细胞成熟的促进作用。17β-E2(1μg/mL)通过GPR30增加山羊COCs中cAMP水平及ERK1/2的磷酸化水平，最终促进了山羊卵丘细胞的扩展。

目录

声明

摘要

第一章 哺乳动物卵母细胞成熟调控的研究进展

1．1 哺乳动物卵母细胞的成熟能力和水平

1．1．1 卵母细胞的形态学因素

1．1．2 卵母细胞的核成熟能力

1．1．3 卵母细胞的胞质成熟能力

1．1．4 卵母细胞的分子成熟

1．2 卵丘细胞在卵母细胞成熟中的作用

1．2．1 卵丘细胞的扩展

1．2．2 卵丘细胞扩展的内分泌和旁分泌调控

1．2．3 雌激素对卵丘细胞扩展的作用

第二章 雌激素及其受体对卵丘细胞扩展的调控

2．1 雌激素经典受体

2．2 雌激素膜受体

2．2．1 GPR30的特异性配体的研究

2．2．2 GPR30的结构和分布

2．2．3 GPR30与其他雌激素受体之间的关系

2．2．4 GPR30介导的信号通路

2．2．5 GPR30的生物学功能

2．3 本研究的目的及意义

第三章 山羊卵丘-卵母细胞复合体中GPR30表达检测

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 山羊COCs中GPR30表达的检测

3．2．2 体外成熟培养24 h前后山羊COCs中GPR30 mRNA表达的检测

3．2．3 体外成熟培养24 h前后山羊卵丘-卵母细胞复合体中GPR30蛋白表达的检测

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 GPR30介导的雌激素信号通路对卵母细胞成熟的调控作用

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 GPR30介导的雌激素对山羊卵母细胞成熟的影响

4．2．2 GPR30介导的雌激素对山羊卵母细胞成熟过程中卵丘扩展的影响

4．3 讨论

4．3．1 GPR30介导的雌激素对山羊卵母细胞成熟的影响

4．3．2 GPR30介导的雌激素对山羊卵母细胞成熟过程中卵丘扩展的影响

4．4 小结

第五章 GPR30介导的雌激素信号通路对山羊卵丘细胞扩展的作用机制研究

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 试验方法

5．2 数据统计与分析

5．3 结果与分析

5．3．2 雌激素通过GPR30对COCs中ERK1／2磷酸化水平的检测结果

5．4 讨论

5．5 小结

结论

参考文献

致谢

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