雌激素膜受体GPR30在山羊卵丘卵母细胞复合体间隙连接通讯中的作用及其机制研究

摘要

哺乳动物卵泡主要由卵泡体细胞和生殖细胞组成，颗粒细胞间、卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间存在着间隙连接(gap junction)，从而形成了一个功能性合胞体。卵泡发育过程中，卵母细胞周围出现透明带，卵丘细胞与卵母细胞膜间形成跨带突触（transzonal cytoplasmic projections, TZPs) ，形似丝状伪足，其末端也形成间隙连接；间隙连接为卵母细胞发育输送大量信号物质和能量，也在卵母细胞成熟调控和排卵过程中发挥重要作用。在卵母细胞自发成熟或促性腺激素诱导的卵母细胞成熟过程中，都伴随着卵泡颗粒细胞间隙连接的减少，卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接则逐渐关闭甚至消失。研究发现，促黄体素(luteinizing hormone, LH)可作用于颗粒细胞的隙连接，终止cGMP等减数分裂抑制物质的传输，诱导卵母细胞恢复减数分裂。雌激素在卵泡发育过程中也能调节间隙连接相关蛋白的表达，但雌激素调控卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complex, COCs)间隙连接通讯功能和相关机制尚不明确。 本研究通过检测山羊COCs体外成熟培养过程中卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD）的发生，研究17β-雌二醇(17β-E2)对GVBD发生的调节及其作用通路，以及TZPs数量和间隙连接通讯动态变化在卵母细胞核成熟过程中的作用，探讨雌激素对山羊COCs间隙连接通讯和卵母细胞核成熟进程的影响，揭示间隙连接在卵母细胞成熟过程中的功能状态及其调控机制。研究内容和结果如下： （1）采用Hoechst33342对山羊卵母细胞核染色后，进行染色质形态观察，检测17β-E2在山羊 COCs 体外培养过程中的作用。山羊 COCs 在基础培养液或添加1μg/mL17β-E2处理，体外培养2, 4, 6 h和8 h ，结果表明在17β-E2处理到4 h和6 h时，卵母细胞GVBD发生率显著高于不添加17β-E2的对照组；进一步采用雌激素核受体（estrogen recepter, ER)抑制剂 ICI182780 ，雌激素膜受体（G protein coupled receptor30, GPR30）抑制剂G15或激动剂G1，研究雌激素促进山羊卵母细胞核成熟进程的受体通路，结果表明，17β-E2促进山羊卵母细胞GVBD的发生的作用能被雌激素膜受体GPR30激动剂G1模仿，而能被GPR30抑制剂G15所抑制；核受体抑制剂ICI182780却不能抑制17β-E2对山羊卵母细胞GVBD发生的促进作用。说明，在山羊COCs体外培养过程中，1μg/mL 17β-E2能够促进卵母细胞提前发生GVBD，这种促进作用是由其膜受体GPR30介导的。 （2）卵母细胞核成熟进程中， TZPs数量和间隙连接通讯功能均会发生动态变化，但这些动态变化是否受雌激素及其受体通路调控，需要进一步验证。利用免疫荧 光技术，检测新鲜分离、成熟培养前山羊COCs中GPR30和间隙连接蛋白CX43的表达与定位，结果表明成熟培养前山羊COCs的卵丘细胞和卵母细胞均存在GPR30和CX43表达，并定位于细胞膜上。为了验证TZPs在17β-E2促进山羊卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用，在COCs体外培养体系中添加或不添加17β-E2，分别在COCs体外培养的0, 6, 24 h检测卵丘细胞和卵母细胞间TZPs的表达数量，发现在体外培养6 h和24 h时，所有COCs卵丘细胞和卵母细胞之间TZPs数量均显著下降（P＜0.05），其中体外培养6 h时17β-E2处理组与不添加17β-E2的对照组相比没有明显差异，而培养24 h时17β-E2处理组TZPs表达数量与对照组相比显著下降(P＜0.05)，提示17β-E2并不是通过影响COCs中TZPs的表达而调控卵母细胞核成熟进程。为了进一步验证间隙连接在17β-E2促进卵母细胞提前发生GVBD中是否发挥作用，在添加1μg/mL 17β-E2的培养体系中培养山羊COCs，在培养前及培养到2, 4, 6, 8 h时，采用显微操作系统分别将荧光黄（lucifer yellow, LY）注入到卵母细胞胞质中，根据荧光黄从卵母细胞向卵丘细胞的扩散程度，监测不同培养时间COCs的间隙连接通讯功能，结果显示从卵泡新鲜分离的山羊COCs间隙连接有87.5％处于开放状态，17β-E2处理4h和6h间隙连接通讯明显下调(P＜0.05)；向COCs培养体系中分别添加1μg/mL 17β-E2或雌激素膜受体激动剂G1，或联合添加17β-E2和雌激素膜受体抑制剂，或联合添加17β-E2和雌激素核受体抑制剂ICI182780，在COCs体外培养的4 h，将COCs转移到含钙黄绿素乙酰甲基酯（Calcein-AM）的磷酸盐缓冲液中，监测钙黄绿素从卵丘细胞向卵母细胞的转移情况，检测雌激素受体通路对间隙连接通讯活性的影响。结果显示,单独添加17β-E2或雌激素膜受体激动剂G1均能下调间隙连接活性、显著抑制钙黄绿素从卵丘细胞向卵母细胞的转移(P＜0.05)；膜受体抑制剂G15的添加阻断了雌激素对间隙连接的抑制作用，而不影响钙黄绿素转移；雌激素核受体抑制剂ICI182780的添加不影响17β-E2对钙黄绿素转移的抑制作用。说明17β-E2会下调COCs中卵丘细胞与卵母细胞间间隙连接通讯，这种下调作用是通过雌激素膜受体GPR30介导的。 （3）为了研究雌激素对山羊COCs卵丘细胞和卵母细胞间间隙连接通讯影响的机制，利用Western Blotting技术，检测17β-E2对山羊COCs 间隙连接蛋白CX43磷酸化水平的影响。结果显示，在17β-E2处理的4 h内COCs 间隙连接蛋白CX43磷酸化水平没有明显变化，在处理到4 h，6 h和8 h时CX43磷酸化水平均显著升高；进一步研究发现，单独使用17β-E2或雌激素膜受体GPR30激动剂G1处理COCs 4 h后，COCs中 GPR30 信号通路关键分子细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase1/2, ERK1/2)和CX43 Ser368磷酸化水平显著高于空白对照组和17β-E2与G15共同处理组；进一步在1μg/mL 17β-E2基础上，共同添加ERK抑制剂PD98059 （50μM），或共同添加GPR30信号通路中另一个关键分子EGFR（ERK上游）的抑制剂AG1478（50μM）时，均能下调ERK1/2和CX43 Ser368的磷酸化水平(P＜0.05)；而17β-E2与雌激素核受体抑制剂ICI182780共同处理时，ERK1/2和CX43 Ser368的磷酸化水平与对照组没有显著差异。说明，雌激素通过GPR30介导山羊COCs 间隙连接蛋白CX43的磷酸化，且EGFR-ERK1/2信号通路参与了这一过程。 （4）为了进一步验证EGFR通路参与了GPR30介导的雌激素对COCs间隙连接蛋白CX43 磷酸化调控。利用qRT-PCR技术，检测山羊卵丘细胞EGFR的配体EGF样因子（AREG, EREG, BTC）的表达。结果显示，单独添加17β-E2或者雌激素膜受体激动剂G1处理4 h，均能增加卵丘细胞中EGF样因子的mRNA表达，且显著高于空白对照组和雌激素膜受体抑制剂G15与17β-E2共同处理组(P＜0.05)；而雌激素核受体抑制剂ICI182780与17β-E2共同处理组与单独添加17β-E2或者G1处理组没有明显差异，说明并ICI182780不影响17β-E2诱导的卵丘细胞EGF样因子的表达。说明，17β-E2通过GPR30介导而促进了EGF样因子mRNA表达。 综上所述，17β-E2通过GPR30促进山羊COCs卵丘细胞EGF样因子的表达，进而激活ERK1/2信号通路，促进COCs的间隙连接蛋白CX43的磷酸化、下调间隙连接通讯，最终促进了卵母细胞核成熟进程。

目录

第一章 哺乳动物卵巢卵泡发育及卵母细胞成熟调控

1.1 哺乳动物卵巢卵泡的生长发育

1.2 卵泡发育调控

1.3 卵母细胞减数分裂的阻滞

1.4 卵母细胞减数分裂的恢复的调控

1.5 间隙连接对卵母细胞减数分裂的调控

第二章 雌激素及其受体对卵母细胞成熟的调控

2.1 雌激素

2.2 雌激素受体

2.3 雌激素的作用途径

2.4 本研究的目的及意义

第三章 雌激素调控山羊卵母细胞核成熟进程研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 雌激素调控山羊COCs间隙连接通讯研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 雌激素调控山羊COCs间隙连接通讯的作用机制研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

结论

参考文献

致谢

作者简介