免疫猪场猪伪狂犬病病毒分离株的生物学特性分析

摘要

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种猪传染病，其临床症状主要为妊娠母猪发生流产和仔猪出现神经症状，给养猪业造成了巨大损失。20世纪90年代我国采取疫苗预防接种而有效控制了该病的流行，但自2011年下半年以来，在我国多个省份用Bartha-K61疫苗免疫接种的猪场相继发生了猪伪狂犬病。本实验室从河北省沙河市和陕西省汉中市几个疫苗免疫猪场发生疑似猪伪狂犬病的病猪分离鉴定出了3株PRV野毒株，分别命名为HB-SH1-2015、HB-SH2-2015和SX-HZ-2015分离株。本研究对3个PRV分离株进行了细胞培养、PRVTCID50测定、家兔感染试验、家兔脑组织和肺组织中病毒载量的测定以及gE基因的核苷酸序列分析，获得了以下结果。
　　(1)3个PRV分离株接毒PK-15细胞后24h出现明显的细胞病变(CPE)，即24h部分细胞出现圆缩和散在的灶状，48h细胞出现圆缩和聚集，72h细胞出现破碎和死亡;病毒滴度在HB-SH1-2015为10-112857TCID50/100μL，HB-SH2-2015为10-13.9027TCID50/100μL,SX-HZ-2015为10-12.2877TCID50/100μL。
　　(2)家兔感染试验结果显示，3个PRV分离株均可使家兔表现出典型的伪狂犬病症状，即精神沉郁，食欲下降，体温升高，部分家兔出现咬毛啃食现象，之后10h内出现体力衰竭、角弓反张、痉挛等症状，全部家兔相继死亡。病理剖检结果显示，3个试验组家兔均出现了典型的PRV病变，肝脏肿大、边缘坏死，肺脏淤血、水肿;脾脏淤血肿大，有坏死灶。real-time PCR检测感染家兔脑组织和肺组织病毒载量的结果显示，脑组织中HB-SH1-2015分离株和HB-SH2-2015分离株病毒量分别为7.5×105copies/g和6.9×105copies/g，无显著差异(P＞0.05);而SX-HZ-2015分离株的病毒量为1.2×106copies/g，显著高于河北的2个分离株(P＜0.05);肺组织中HB-SH1-2015分离株和HB-SH2-2015分离株的病毒量分别为3.8×1010copies/g和3.4×1010copies/g，无显著差异(P＞0.05);而SX-HZ-2015分离株的病毒量为7.6×1010copies/g，极显著高于河北的2个分离株(P＜0.01)。提示SX-HZ-2015分离株对家兔脑组织和肺组织的侵染性明显强于HB-SH1-2015分离株和HB-SH2-2015分离株。
　　(3)PRV gE基因核苷酸序列比结果显示，HB-SH1-2015分离株与HB-SH2-2015分离株gE基因核苷酸同源性为99.9％，而SX-HZ-2015分离株与它们的同源性为99.3％，进行gE基因的突变位点比对，发现SX-HZ-2015分离株相对于HB-SH1-2015分离株和HB-SH2-2015分离株存在部分位点的缺失和变异;HB-SH1-2015分离株和HB-SH2-2015毒株与2012年之后国内的分离毒株的同源性高达99.0％～99.9％，而SX-HZ-2015毒株与国内流行的PRV毒株同源性相对稍低(98.3％～99.0％);遗传进化树显示，3个分离株与国内大部分的PRV流行株同属于同一个分支，说明3个分离株在基因水平上没有明显的突变，均属于国内常见的PRV毒株。

目录

声明

摘要

第一章 猪伪狂犬病研究进展

1．1 猪伪狂犬病的流行状况

1．2 猪伪狂犬病的临床症状

1．3 伪狂犬病病毒的分子生物学特征

1．4 猪伪狂犬病的疫苗研究

1．5 猪伪狂犬病的诊断

1．5．1 病毒的分离与鉴定

1．5．2 动物接种试验

1．5．3 分子生物学诊断方法

1．5．4 其他诊断方法

1．6 猪伪狂犬病的综合防控措施

1．7 本研究的目的和意义

第二章 PRV分离株的致病性和感染家兔部分组织的病毒载量

2．1 材料与方法

2．1．1 病毒来源

2．1．2 细胞和动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．2 细胞的传代培养

2．2．3 病毒的细胞培养和毒液的收取

2．2．4 PRV TCID50的测定

2．2．5 家兔感染试验

2．2．6 病理剖检及病料采集

2．2．7 real-time PCR检测感染家兔脑和肺组织中的病毒载量

2．3 结果

2．3．1 分离毒株的致细胞病变作用

2．3．2 PRV分离株的病毒滴度

2．3．3 家兔感染试验

2．3．4 感染家兔脑和肺组织中的病毒载量

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 PRV分离株gE基因的序列分析

3．1 材料与方法

3．1．1 病毒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 病毒DNA的提取

3．1．4 引物的设计与合成

3．1．5 目的片段的扩增

3．1．6 琼脂糖凝胶电泳

3．1．7 PCR产物的纯化

3．2．1 gE基因两段序列的PCR扩增

3．2．2 PRV分离株gE基因的测序结果

3．2．3 PRV分离株gE基因序列的分析

3．3 讨论

3．4 小结

结论

参考文献

致谢

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