表面展示猪不同亚型IgG Fc的重组杆状病毒疫苗载体研究

摘要

与其他的病毒载体系统比较，杆状病毒用于基因转移和疫苗递送拥有显著的优势，如插入外源片段容量大、操作简单、生物安全性高（不具有整合性和哺乳动物致病性）以及哺乳动物中不存在针对杆状病毒的先天免疫。携带哺乳动物病毒活性启动子的重组杆状病毒（BacMam virus）用于哺乳动物细胞的转基因而被广泛研究。
　　然而，杆状病毒用于哺乳动物的基因转移仍面临两大瓶颈:哺乳动物补体系统的清除和哺乳动物细胞转导效率低，尤其是针对树突细胞(DCs)、巨噬细胞(MΦ)、B细胞和T细胞等免疫细胞表现出极低的转导效率。这在一定程度上限制了杆状病毒载体疫苗的效力。本实验室前期研究发现，表面展示猪IgG1 Fc可通过增强杆状病毒补体逃逸和转导哺乳动物细胞从而提高杆状病毒载体疫苗的效力。IgG Fc在体内主要通过转运途径(FcRn)、补体途径(C1q)和免疫细胞识别途径（FcγRI）来调控诱导免疫反应。考虑到猪不同亚型IgG Fc在结构上存在明显差异，在与上述三种途径识别受体的结合能力方面也存在差异。本研究通过尝试构建表面展示不同亚型IgG Fc的杆状病毒，探究不同亚型IgG Fc是否具有类似IgG1 Fc的功能，并筛选更具佐剂潜力的IgG Fc亚型，为构建高效的拮抗补体重组杆状病毒疫苗载体提供理论支持和技术手段。本研究取得了以下结果:
　　1.重组杆状病毒的构建和鉴定
　　本试验基于MultiBac杆状病毒表达系统，通过在载体pFBDM-P10-gp64SP-vsvgED多克隆位点中插入不同亚型IgG Fc构建杆状病毒转移载体，经脂质体介导的方法转染Sf9昆虫细胞包装重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光分析显示目的基因正确正确表达并定位在重组杆状病毒表面。这些结果表明，成功构建了8种展示不同亚型IgGFc的VSV-G假型化的重组杆状病毒。
　　2.重组杆状病毒的猪血清补体系统拮抗能力和体外转基因表达评价
　　通过体外试验比较展示不同亚型IgG Fc的重组杆状病毒在猪血清中的存活率，与对照病毒BV-vsvg相比(16.59％)，展示猪不同亚型IgG Fc的重组杆状病毒存活率均显著提高，其中BV-vsvg-pFc2(52％)最高，其次是BV-vsvg-pFc3(49.39％)和BV-vsvg-pFc(47.2％)。而展示人IgG1 Fc的重组病毒（BV-vsvg-hFc和BV-vsvg-rhFc）存活率(17.04％～23.9％)与对照病毒没有显著差异。转导IEC细胞后，转基因表达结果显示，展示猪IgG Fc不同亚型的重组杆状病毒在转导效率和转基因表达上较对照病毒均有显著增强，其中BV-vsvg-pFc3最高，其次是BV-vsvg-rpFc3、BV-vsvg-pFc2和BV-vsvg-pFc。而由于种属性差异，展示人IgG1 Fc的重组杆状病毒BV-vsvg-hFc和BV-vsvg-rhFc在转基因表达水平上与对照病毒BV-vsvg均无显著差异。
　　3.展示Fc重组杆状病毒与Fc激活型受体FcγRI结合能力比较
　　通过构建FcγRI表达载体，成功表达和纯化了猪IgG Fc激活型受体FcγRI。选取在补体逃逸和转基因表达两个方面都有良好表现的3株重组杆状病毒，以重组FcγRI作为包被物，通过ELISA分析比较其与FcγRI的结合能力，其中BV-vsvg-pFc3与FcγRI结合能力最强，其次是BV-vsvg-pFc2和BV-vsvg-pFc。
　　综上，本研究构建了8种展示不同亚型IgG Fc的重组杆状病毒，补体拮抗能力、体外转基因表达和与激活型受体FcγRI结合活性三个评价指标显示，表面展示猪IgG3 Fc(pFc3)的重组杆状病毒用于猪用载体疫苗的研发更具发展潜力。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 杆状病毒载体及IgG Fc研究进展

1．1 杆状病毒作为基因递送载体

1．1．1 杆状病毒体外转导条件的优化

1．1．2 增强转基因表达的策略

1．1．3 BacMam与宿主抗病毒免疫

1．2 杆状病毒表面展示系统

1．2．1 GP64作为杆状病毒展示系统的融合分子

1．2．2 肽段插人天然的GP64

1．2．3 可选择的其他展示策略

1．3 杆状病毒与其他基因递送系统的比较

1．4 杆状病毒与补体系统

1．4．1 补体系统

1．4．2 杆状病毒激活补体的途径

1．4．3 拮抗补体杆状病毒载体研究

1．5 IgG Fc研究进展

1．5．2 猪IgG1 Fc及受体研究进展

1．6 本研究的目的和意义

第二章 表面展示猪不同亚型IgG Fc重组杆状病毒的构建

2．1 试验材料

2．1．1 质粒、菌株、细胞

2．1．2 主要试剂及仪器

2．1．3 主要溶液

2．1．4 引物设计与合成

2．2 方法

2．2．1 pFBDM-P10-gp64SP-vsvgED-Fc转移载体的构建

2．2．2 重组杆状病毒穿梭载体的构建

2．2．3 重组杆状病毒的包装和滴定

2．2．4 重组杆状病毒的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 pFBDM-P10-gp64SP-vsvgED-Fc转移载体的构建

2．3．2 重组穿梭载体Bacmid的构建和鉴定

2．3．3 重组杆状病毒的扩增和滴度测定

2．3．4 重组杆状病毒的PCR鉴定

2．3．5 重组杆状病毒的Western blot鉴定

2．3．6 重组杆状病毒的间接免疫荧光分析(IFA)

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 展示Fc重组杆状病毒的转基因潜力评价

3．1 试验材料

3．1．1 菌株、质粒、细胞

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要溶液和培养基的配置

3．2 方法

3．2．1 展示不同亚型IgG Fc重组杆状病毒体外补体逃逸活性检测

3．2．2 展示不同亚型IgG Fc重组杆状病毒在IEC细胞上转基因表达能力的比较

3．3 结果

3．3．1 展示不同亚型IgG Fc重组杆状病毒补体拮抗能力比较

3．3．2 展示不同亚型IgG Fc重组杆状病毒在IEC细胞上的转基因表达能力比较

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 展示Fc重组杆状病毒与Fc受体结合能力分析

4．1 试验材料

4．1．1 质粒、菌株

4．1．2 主要试剂及仪器

4．1．3 主要溶液配制

4．2 方法

4．2．1 FcγRI蛋白的原核表达

4．2．2 间接ELISA检测FcγRI与展示Fc重组杆状病毒结合能力

4．3 结果

4．3．3 间接ELISA检测FcγRI与展示Fc重组杆状病毒结合能力

4．4 讨论

4．5 小结

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介