转录因子MdHB1调控‘澳洲青苹’苹果花青苷合成的分子机制研究

摘要

果实着色情况在很大程度上影响了果实的商品特性和营养价值。苹果（Malus×domestica）果皮和果肉的红色性状主要是由花青苷累积造成的，红肉苹果因富含花青苷而具有重要的经济和生物学价值。花青苷积累调控机制的研究对果实品质提高和红肉苹果分子育种均有重要意义。
　　HD-Zip蛋白是植物界所特有的一大类转录因子，广泛调控植物的生长发育和逆境防御反应，但其与花青苷积累间的关系尚不明晰。本研究从‘澳洲青苹’中克隆得到了一个HD-ZipⅠ转录因子MdHB1，采用农杆菌介导的瞬时转化技术研究明确了MdHB1与‘澳洲青苹’果肉花青苷积累的调控关系，并结合生理、生化实验揭示了MdHB1调控花青苷合成的可能机制。主要研究结果如下:
　　(1)MdHB1蛋白含有336个氨基酸，属于HD-ZipⅠ转录因子家族。进化树分析得知，苹果的MdHB1、番茄的LeHB1和拟南芥的AtHB1紧密聚类在一起。定量RT-PCR检测结果显示，MdHB1在‘澳洲青苹’的花、叶、果等组织中均有表达;在果实发育过程中，MdHB1在幼果期和可采成熟期果实的果肉中转录水平较高。亚细胞定位结果表明，花椰菜花叶病毒35S启动子诱导下，MdHB1-GFP在细胞质内广泛分布，同时在细胞核内聚集;MdHB1启动子诱导下，GFP荧光主要分布在细胞质内。
　　(2)在可采成熟度的‘澳洲青苹’果实中沉默MdHB1可以导致其果肉组织中积累大量红色物质。高效液相色谱鉴定得知，该红色物质主要为矢车菊素3-O-阿拉伯糖苷，属于花青苷类物质。定量RT-PCR分析表明，沉默MdHB1基因可显著提高花青苷合成结构基因(MdDFR和MdUFGT)和调控基因（MdMYB10）的转录丰度。相反，瞬时过表达MdHB1降低了红肉苹果‘芭蕾’果肉花青苷的含量及MdDFR、MdUFGT和MdMYB10的转录水平;稳定过表达MdHB1的转基因‘NC89’烟草（Nicotiana tabacum）花冠颜色比野生植株的花冠颜色浅，花青苷合成受到显著抑制。由此可见，HD-ZipⅠ转录因子MdHB1组织特异性地负调控花青苷合成，且该过程与DFR、UFGT和MYB10等基因的表达密切相关。
　　(3)利用双荧光素酶系统和GUS报告基因系统检测转录因子对启动子的调控作用。结果显示，MdMYB10激活MdDFR和MdUFGT启动子的转录活性，这种作用可被MdbHLH3和MdTTG1转录因子加强;MdHB1抑制MdDFR和MdUFGT启动子的转录活性，并干扰MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1转录因子对上述启动子的转录激活作用。酵母单杂交实验显示，MdHB1不结合MdDFR和MdUFGT启动子序列，即MdHB1间接负调控MdDFR和MdUFGT的表达。
　　(4)在‘澳洲青苹’果肉中，沉默MdMYB10可抑制花青苷合成关键基因MdDFR和MdUFGT的转录;MdHB1沉默所产生的红肉表型在共沉默MdMYB10和MdHB1时消失。由此可见，MdMYB10对于果肉着色是必不可少的。
　　(5)GUS报告基因瞬时转化实验表明，MdHB1和MdMYB10在烟草中均抑制MdMYB10和MdHB1启动子的转录活性，推测MdHB1和MdMYB10在‘澳洲青苹’中互相负调控。
　　(6)酵母双杂交和双分子荧光互补结果显示，两个MdHB1蛋白可在细胞质内结合形成同源二聚体;MdHB1蛋白与MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1蛋白的结合也发生在细胞质内，其中与MdbHLH3的结合最弱，与MdMYB10-MdbHLH3-MdTTG1复合物的结合最强。
　　综上所述，推导出一个MdHB1负调控‘澳洲青苹’果肉花青苷合成的模型:正常条件下，MdHB1募集MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1转录因子，将其束缚在细胞质内，间接抑制MdDFR和MdUFGT基因的表达;当通过RNA干扰等途径降低Md HB1基因的转录水平时，MdMYB10、MdbHLH3和MdTTG1转录因子被释放，并于细胞核内激活花青苷合成关键基因MdDFR和MdUFGT的转录，促进花青苷的积累，进而导致‘澳洲青苹’果肉呈现红色。本研究不仅拓展了HD-ZipⅠ蛋白的生物学功能，更补充丰富了花青苷合成的调控机制，为红肉苹果的分子育种提供理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 花青苷的生物合成

1．2 MYB-bHLH-WD40(MBW)转录因子对花青苷合成调控的研究

1．2．1MYB转录因子

1．2．2 bHLH转录因子

1．2．3 WD40转录因子

1．3 其他转录因子对花青苷合成调控的研究

1．4 HD-Zip转录因子的研究进展

1．4．2 HD-Zip Ⅰ转录因子的研究进展

1．4．3 HD-Zip转录因子与花青苷的研究

1．5 研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．2 MdHB1及其启动子的克隆与分析

2．3 定量RT-PCR

2．4 亚细胞定位

2．5 GUS染色确定农杆菌瞬时转化的侵染范围

2．5．1 GUS染色液的配置

2．5．2 苹果果片GUS染色方法

2．5．3 GUS蛋白定量

2．6 基因瞬时沉默

2．6．1 TRV载体构建

2．6．2 MdHB1沉默片段筛选

2．6．3 瞬时沉默MdHB1

2．8 在烟草中稳定过表达MdHB1

2．9 花青苷含量测定

2．9．1 高效液相色谱法

2．9．2 分光光度计法

2．10 荧光素酶检测

2．10．1 双荧光素酶载体构建

2．10．2 双荧光素酶实验流程

2．10．3 萤火虫荧光素酶活力图像采集

2．11 GUS实验鉴定启动子转录活性

2．11．1 GUS载体构建

2．11．2 烟草叶片GUS染色方法及GUS蛋白定量

2．12 酵母单杂交实验

2．12．1 酵母单杂交载体构建

2．12．2 酵母单杂交实验流程

2．13 酵母双杂交实验

2．13．1 酵母双杂交载体构建

2．13．2 酵母双杂交实验流程

2．14 双分子荧光互补实验

2．14．1 双分子荧光互补载体构建

2．14．2 双分子荧光互补实验流程

2．15 数据统计与图像绘制

第三章 结果与分析

3．1 MdHB1基因克隆与分析

3．2 MdHB1亚细胞定位

3．3 MdHB1瞬时沉默在白肉苹果‘澳洲青苹’果实中的表型鉴定

3．4 MdHB1瞬时过表达在红肉苹果‘芭蕾’果实中的表型鉴定

3．5 MdHB1过表达的转基因‘NC89’烟草表型观察

3．6 MdHB1和MdMYB10拮抗调控MdDFR和MdUFGT的表达

3．7 MdHB1和MdMYB10共沉默对‘澳洲青苹’果肉着色的影响

3．8 MdHB1与MBW转录因子间的结合

第四章 讨论

4．2 MdMYB10对‘澳洲青苹’果肉着色具有重要意义

4．3 MdHB1负调控花青苷合成的推测机制

第五章 结论与创新点

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介