猪多能干细胞3i培养体系的建立

摘要

多能干细胞的发展为再生医学、疾病模型和药物筛选等研究提供了理想的研究材料。由于猪的生理结构和器官大小与人接近，饲养较为容易，是理想的实验动物模型。猪多能干细胞的建系工作进展与人和小鼠相比非常缓慢，其难度主要在于未寻找到适合猪多能干细胞的培养条件。本研究以药物介导外源基因表达的猪iPS细胞为材料，通过筛选以确认能够维持猪iPS细胞自我更新的培养体系。实验结果如下：
　　1.猪DOX-iPS细胞的建立和鉴定
　　以强力霉素（Doxycycline, Dox）介导的慢病毒表达载体（携带四串联表达的鼠源四因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）转导猪胎儿成纤维细胞后，通过在添加Dox的LF2i培养基中培养5-7天后，可获得小鼠ES细胞样克隆。通过挑取和筛选，获得了三株形态立体、边缘整齐、AP染色阳性的DOX-iPS细胞克隆。经检测，三株DOX-iPS细胞的基因组中钧有FUW-TetO-OSKM和FUW-M2rtTA结构插入、表达特定的多能基因、OCT4和SOX2蛋白高表达且定位于细胞核、SSEA-1蛋白定位于细胞膜、NANOG蛋白的表达不明显。进一步鉴定结果表明，三株DOX-iPS细胞染色体数正常（36+XY），细胞经悬浮培养后可形成类胚体，类胚体自发分化的细胞表达三胚层特异标记物AFP、TUJ1和DESMIN。上述结果表明，诱导得到的三株猪DOX-iPS细胞均表达多能相关基因，可在体外分化成三胚层细胞，具备了基本的多能性。
　　2.建立Dox调控的细胞重编程体系
　　Dox可调控外源多能基因的表达，为检测猪DOX-iPS细胞受Dox调控的作用，在培养基中添加或撤除Dox，观察细胞多能性状态的变化情况。当Dox从LF2i培养基中撤除后，DOX-iPS细胞的克隆形态逐渐消失，再将培养基中的细胞因子撤除后，DOX-iPS细胞完全分化为AP染色阴性的成纤维样细胞。分化的细胞（DOX-iPSdiff）基因组中仍保留插入的外源元件，且成纤维细胞标记基因的表达量随细胞分化程度而提高。将分化的细胞重新置于含有Dox的LF2i培养基中培养4天，AP阳性克隆重新产生，形成的二代DOX-iPS细胞(DOX-iPS2nd)克隆可继续传代并保持原有的克隆形态。二代iPS细胞表达外源和内源多能基因，与一代DOX-iPS细胞无明显差异。本实验建立了Dox调控的细胞重编程体系，通过添加或撤除Dox，调控DOX-iPS细胞的多能状态。该体系为筛选猪iPS培养条件提供了实验条件。
　　3.筛选和建立猪iPS的2i培养条件
　　我们利用上述Dox调控的DOX-iPS体系，对维持猪PSCs多能性的培养条件进行了筛选。与LF2i培养条件相比，在2i培养条件中撤掉LIF、b-FGF、CHIR99021和SB431542后发现，LIF和b-FGF的撤除使得iPS克隆形态更为立体，AP着色更深，内源OCT4、SOX2和NANOG的表达量更高。随后，将DOX-iPSdiff细胞分别置于LF2i和2i培养条件中进行诱导重编程后发现，LF2i条件下克隆形成效率更高，克隆形态较好，而2i条件下克隆数量较少且无法长期传代。再用LF2i和2i培养条件对PEF细胞进行重编程诱导时，也得到了类似结果，说明单独的2i培养条件尚不能有效进行细胞重编程。此结果显示，猪体细胞重编程的起始阶段需要LF2i培养条件，但是，在猪多能干细胞阶段就不需要LIF和b-FGF，而2i培养条件即可有效维持iPS细胞的多能状态，前提条件是需要有Dox的存在。
　　4.3i培养条件的建立
　　2i培养条件可提高DOX-iPS细胞内源多能基因的表达水平，但是iPS细胞的自我更新仍依赖Dox介导的外源基因表达。我们尝试通过在2i培养体系的基础上添加不同的细胞因子和小分子，激活内源基因的表达，从而维持DOX-iPS细胞自我更新的能力。在2i体系中添加BMP4、SCF、IL-6，并同时添加血小板裂解物（Platelet Lysates, PL）以替代血清后，DOX-iPS细胞内源OCT4和NANOG表达显著提高；撤除Dox后，部分iPS克隆仍能维持AP阳性状态，但持续传代能力较差。因此，我们在新的培养体系中再加入小分子PD0325901，使DOX-iPS细胞能够在撤除Dox条件下维持较好的克隆形态和较高的内源多能基因表达。此培养条件即为3i培养条件。将不同来源的猪多能干细胞在3i条件中培养，均能维持其自我更新能力，且内源多能基因的表达有不同程度的提高。以上结果表明，我们通过筛选建立了全新的无Dox无LIF/bFGF无血清的3i培养条件，该条件可维持猪PSCs的自我更新能力。

目录

声明

第一章 多能性建立的方法和猪多能干细胞研究进展

1.1多能性建立的方法

1.2猪多能干细胞研究进展

第二章 多能干细胞培养体系的研究进展

2.1 多能状态的分类

2.2 维持多能状态的培养条件

2.3 猪多能干细胞培养条件研究

试验研究

前言

第三章 猪DOX-iPS细胞系的建立与验证

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

第四章 建立Dox调控的细胞重编程体系

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4 小结

第五章 筛选和建立猪iPS的2i培养条件

5.1材料和方法

5.2结果

5.3讨论

5.4小结

第六章 3i培养条件的建立

6.1 材料和方法

6.2 结果

6.3 讨论

6.4 小结

结论

论文创新点及下一步研究方向

创新点：

下一步研究方向：

参考文献

附录

缩略词

致谢

作者简介