猪精原干细胞体外培养体系的建立

摘要

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性哺乳动物精子发生及具有生育能力的保障.精原干细胞的体外培养不仅为精子发生的研究提供材料,还有助于开发新的家畜保种方法和动物遗传修饰.为了探索猪精原干细胞体外培养体系的建立方法,本研究采用胶原酶Ⅳ-胰酶两步酶法对3～7日龄大白仔猪睾丸进行消化得到单细胞悬液,利用不同时间程序的差速贴壁对精原干细胞进行纯化,选择大白仔猪睾丸支持细胞作为饲养层,添加不同细胞因子研究精原干细胞的增殖情况以期得到最佳的培养体系.结果显示,通过差速贴壁得到的UCHL-1阳性生殖细胞比例最高为18.59％ ±0.94％;不同细胞因子组合添加试验发现精原干细胞添加20 ng·mL-1 GDNF、10 ng·mL-1 IGF和20 ng·mL-1 bFGF的增殖效果最佳;以支持细胞作为饲养层、在DMEM/F12中添加1％FBS以及上述细胞因子组合对精原干细胞进行培养15 d后可见大量的精原干细胞集落,通过免疫荧光、AKP染色、荧光定量PCR等试验证明精原干细胞进行了大量增殖.本研究初步建立了猪精原干细胞的体外培养体系,可通过体外培养大量增殖精原干细胞,为后续精原干细胞的研究奠定基础.