黑色素对大丽轮枝菌微菌核发育及存活的影响

摘要

大丽轮枝菌Verticillium dahliae是一种典型的土传病原真菌，其寄主范围广泛，能为害660多种植物，引致系统性维管束病害黄萎病，每年因黄萎病危害造成的经济损失达数十亿美元。大丽轮枝菌一旦成功入侵寄主，会定殖在寄主维管束组织，导致现有的防治措施收效甚微。微菌核是大丽轮枝菌的长期存活结构，也是黄萎病的主要初侵染源，其细胞壁表面和细胞间隙附着大量DHN黑色素。为了有针对性地开发黄萎病防治新策略，对黄萎病进行有效防控，迫切需要深入明确该病菌的发育机制和存活动态。
　　本文从大丽轮枝菌突变体库的构建入手，利用基因敲除和互补技术明确了DHN黑色素合成途径上6个基因（VdPKS、Vayg1、VdT4HR、VdSCD、VdT3HR、VdLAC）对微菌核发育和致病的影响，并利用DHN黑色素缺陷型突变体ΔVdPKS和ΔVdT4HR及大丽轮枝菌寄主和非寄主土壤研究了黑色素、生防制剂和土壤微生物群落及其互作对微菌核存活的影响。取得了以下主要结果：
　　（1）利用农杆菌介导的遗传转化技术将含有hygB筛选抗性且带有GFP标记的pBIG2RHPH2-GFP-GUS质粒T-DNA区插入大丽轮枝菌基因组内，构建了大丽轮枝菌XJ2008菌株T-DNA插入突变体库，获得了1405个随机插入突变体。对其中48个突变体在PDA培养基上的菌落形态、BMM培养基上的微菌核产生能力和黑色素合成能力及对感病棉种冀棉11的致病力差异等特性进行了研究。结果表明，48个突变体中有20个突变体在PDA培养基上的菌落形态与野生型XJ2008菌株不同；有37个突变体在BMM培养基上无法形成微菌核，有3个突变体不能形成黑色微菌核，有8个突变体形成的黑色微菌核与野生型菌株相同；致病力显著下降的突变体有19个，致病力显著增强的突变体有2个，另外的27个突变体致病力与野生型菌株差异不显著。
　　（2）大丽轮枝菌Vayg1基因和VdT3HR基因同时参与DHN黑色素合成、微菌核形成和致病这3个过程，但VdPKS、VdT4HR、VdSCD和VdLAC基因只参与黑色素合成、不参与微菌核形成和致病过程。Vayg1基因编码的氨基酸序列含有黑色素合成相关催化酶的保守活性位点，利用同源重组法敲除大丽轮枝菌Vayg1基因，敲除突变体ΔVayg1丧失了微菌核产生能力。Vayg1-gfp融合基因仅在微菌核部位表达，发射明亮的绿色荧光。Vayg1基因正向调控黑色素合成途径下游VdT4HR、VdSCD、VdT3HR和VdLAC基因以及黑色素合成相关的转录因子VDAG_00194和VDAG_00195的表达。ΔVayg1对冀棉11的致病力显著下降。敲除DHN黑色素合成途径上的基因VdT3HR后，敲除突变体不能合成1,3,8-三羟基萘还原酶，也无法形成微菌核且致病力显著下降；敲除DHN黑色素合成途径上的其他4个关键酶编码基因VdPKS、VdT4HR、VdSCD和VdLAC后，敲除突变体产生的微菌核分别为无色、深橘色、橘粉色和深棕色，但它们的致病力与野生型菌株无显著差异。
　　（3）黑色微菌核比黑色素缺陷型微菌核在土壤中的存活率高，微菌核存活率的时序动态基本符合负指数模型。来自野生型菌株的黑色微菌核和2种突变体的黑色素缺陷型微菌核之间的差异是花盆内变异的主要来源，占3种菌株间总体差异的91.5％。黑色微菌核（JY）、橘色微菌核（ΔVdT4HR）和无色微菌核（ΔVdPKS）在土壤来源和生防制剂这两个因子综合作用下的平均死亡率分别为0.337、0.493和0.559。寄主（棉花、辣椒）土壤和非寄主（玉米、小麦）土壤来源的差异占花盆间总体差异的50.5%，在黑色素和生防制剂这两个因子的综合作用下，微菌核在棉花、辣椒、玉米和小麦田土壤中的平均死亡率分别为0.307、0.446、0.571和0.528，表明非寄主土壤中含有的大丽轮枝菌抑菌微生物多于寄主土壤。生防制剂处理能加速微菌核死亡，生防制剂处理的主效应占花盆间总体差异的46.3%。微菌核在添加芽孢杆菌制剂、木霉菌制剂和空白对照（不添加生防制剂）土壤中的平均死亡率分别为0.556、0.502和0.331。黑色素、土壤来源和生防制剂这3个因子之间的互作效应占花盆内变异来源的17.9%，对微菌核在土壤中的存活具有显著影响。互作的主要特点是：（1）黑色微菌核在棉花和辣椒田土壤中存活率较高；（2）黑色素缺陷型微菌核在生防制剂处理下的死亡率较高。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 大丽轮枝菌与黄萎病

1.2 微菌核的形成

1.3 黑色素的合成

1.4 DHN黑色素与真菌抗逆性的关系研究

1.5 DHN黑色素与真菌致病力的关系研究

1.6 真菌基因功能研究方法

1.7 黄萎病防治策略

1.8 研究目的和意义

第二章 大丽轮枝菌T-DNA突变体库的构建

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 黑色素合成途径上各基因与微菌核形成及致病的关系

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 黑色素对微菌核在土壤中存活的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 结论与创新点

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介