大丽轮枝菌微菌核发育异常突变体的筛选及其相关基因的鉴定

摘要

为了更加深入的分析研究大丽轮枝菌微菌核发育相关基因的功能，利用农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法，成功构建了大丽轮枝菌菌核型菌株V08DF1、中间型菌株VBp2的突变体库，其中产生大量黑色微菌核的V08DF1库中包含2000个转化子，产生少量黑色微菌核的VBp2库中包含1000个转化子。从菌核型菌株V08DF1库中筛选出14株不产微菌核的突变体，分别是1C2、2H3、5G4、6I7、7E6、9G4、10B5、10E1、11A6、11B7、11C3、11G3、12C8、12I3。从中间型菌株VBp2库中筛选到9株微菌核发育异常的突变体，包括4株在查氏平板上产紫黑色素的突变体，分别为7C8、7H4、9B1、9C10，与5株在查氏培养基上不生长的突变体，分别为7F4、10B10、10C6、10E12、10G8。对上述23株微菌核发育异常的突变体进行T-DNA插入的PCR验证，均能扩增到潮霉素抗性基因。通过Southern杂交对V08DF1库中筛选出的14株微菌核发育异常突变体进行检测，结果表明7个为单拷贝插入，5个为双拷贝插入，2个为三拷贝插入。7株单拷贝插入的微菌核发育异常的突变菌株，分别是6I7、10B5、10E1、12C8、12I3、1C2和2H3。Southern杂交检测VBp2库中筛选出的微菌核发育异常的突变体，仅有突变体7F4、9B1、10E12获得结果，这3株突变体均为双拷贝插入。这些微菌核异常突变体的获得为进一步克隆参与调控微菌核形成发育的基因奠定了基础。
　　由于单拷贝突变体易于找出它们的T-DNA插入位点，可进一步找出被破坏的微菌核发育相关基因，所以重点研究单拷贝插入的突变体。随机选择2H3和1C2这2个单拷贝插入的突变体进行微菌核发育相关基因的研究。首先利用TAIL-PCR方法找到T-DNA区的插入位点，并通过与美国BROAD研究所公布的大丽轮枝菌的全基因组数据库以及NCBI网站上的序列进行BLAST，找到并分析T-DNA区插入的侧翼序列与微菌核发育相关基因。结果表明突变体2H3被T-DNA区破坏的基因编码conidialyellow pigment biosynthesis polyketide synthase，基因编号为VDAG_00190.1，对其基因功能成功进行了回补与敲除验证，其中，2H3的回补转化子共得到7个，并且这些转化子的表型也都得到了恢复，敲除转化子共得到5个，经过了Southern杂交验证，确定是定点敲除，得到的敲除转化子均为单拷贝，初步证实了这个基因确实与微菌核发育有关。突变体1C2被破坏的微菌核发育相关基因为一个假设蛋白，基因编号为VDAG_01680.1，对其基因功能进行了回补验证，共得到1个阳性回补转化子。另外，对双拷贝突变体5G4和9G4用Tail-PCR方法与质粒拯救方法寻找其T-DNA区插入的位点，最终只获得其中一个插入位点，所以后续的基因功能验证工作很难开展。推测突变体5G4可能破坏下游的G931P828RE17.T0基因表达序列标签;突变体9G4可能被破坏的基因也编码假设蛋白，基因编号为VDAG09865.1。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 大丽轮枝菌

1．1．1 大丽轮枝菌的形态特征及致病特性

1．1．2 大丽轮枝菌的定殖过程及其生活史

1．1．3 大丽轮枝菌的遗传学研究

1．1．4 大丽轮枝菌基因组数据库

1．1．5 不同培养基对大丽轮枝菌研究的应用

1．2 大丽轮枝菌微菌核的相关研究

1．2．1 无机元素对大丽轮枝菌微菌核形成与萌发的影响

1．2．2 不同pH、温度等对大丽轮枝菌微菌核生长的影响

1．2．3 RNA-Seq法分析微菌核形成不同阶段的基因表达情况

1．2．4 微菌核发育相关基因的研究

1．2．5 微菌核发育相关基因敲除与回补研究相关技术

1．3 本论文的研究目的和主要研究内容

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究内容

第二章 棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及微菌核发育异常突变体的筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 VBp2与V08DF1T-DNA插入突变体库的构建

2．2．2 微菌核发育异常突变体的筛选

2．2．3 微菌核发育异常突变体T-DNA插入的PCR验证

2．2．4 微菌核发育异常突变体T-DNA插入拷贝数的验证

2．3 讨论

第三章 微菌核发育相关基因的鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 突变体2H3的T-DNA插入位点及微菌核发育相关基因的回补与敲除验证

3．2．2 突变体1C2的T-DNA插入位点及微菌核发育相关基因的回补验证

3．2．3 突变体5G4的T-DNA插入位点及微菌核发育相关基因的回补验证

3．2．4 突变体9G4的T-DNA插入位点及微菌核发育相关基因的回补验证

3．3 讨论

第四章 全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢