苹果树腐烂病菌全基因组解析及两个外泌蛋白被植物识别的机制研究

摘要

由Valsa mali引起的苹果树腐烂病是危害苹果生产最为严重的病害之一，该病菌主要侵染皮层和韧皮部，导致树皮腐烂，严重时可致整树枯死，但基因组序列的缺乏严重限制了在分子水平对其致病机理的解析。病原菌与植物长期的协同进化过程中，病菌分泌毒性蛋白来调控植物的生理过程和免疫反应以促进病菌的侵染，但这些蛋白也很容易被植物识别并激发免疫反应。利用基因组分析研究苹果树腐烂病菌适应性侵染定殖树皮的机理，明确病菌分泌的毒性蛋白被植物识别的机制，将有助于理解病害的成灾规律、植物的抗病机制及制定有效的防治策略。因此，本研究在完成了苹果树腐烂病菌基因组测序的基础上，通过进行比较基因组分析及致病相关基因的预测鉴定，并探明了鉴定到的两个病菌分泌蛋白VmPR1c和VmEXLX1被植物识别的机制，获得的主要结果和结论如下： 基因数量和基因水平转移驱动苹果树腐烂病菌适应性定殖树皮。利用高通量测序及光学图谱辅助拼接，获得了高质量的V. mali基因组序列，其完整度为96.7%，包括13条染色体级别的scaffolds。V. mali分泌蛋白酶的最适pH大多为酸性，并发现对真菌在酸性环境中正常生长至关重要的G01家族在V. mali基因组中显著扩张。V. mali基因组含有大量的胞壁降解酶类，但相比其它真菌扩张的主要为果胶酶类，而降解木质纤维相关酶类相对较少，并且降解木质素的关键酶AA5 家族基因在腐烂菌基因组中缺失；此外，大部分果胶酶基因在侵染过程显著上调表达，经免疫细胞化学分析显示，腐烂菌主要降解苹果树皮中的果胶。相比其它真菌，V. mali的次生代谢基因簇数量显著增多，在侵染过程上调表达的主要为非核糖体多肽类基因。基因水平转移分析鉴定到的32个基因，功能涉及与环境微生物竞争、氮利用和致病等，可能在驱动病菌适应性定殖树皮中发挥重要作用。 Expansin-like蛋白VmEXLX1被植物SRLK识别。VmEXLX1在侵染早期上调表达，表明VmEXLX1可能是重要的致病因子。过表达该基因后，病菌的致病力显著降低，在本氏烟中瞬时表达后诱导细胞死亡并显著提高本氏烟对核盘菌的抗性，表明 VmEXLX1 可被植物识别并激发免疫反应。亚细胞定位分析发现， VmEXLX1 定位于植物细胞膜，并且信号肽缺失后不能在烟草中诱导细胞死亡，表明 VmEXLX1 很可能在质外体发挥功能。进一步利用质谱、双分子荧光互补和免疫共沉淀分析，在本氏烟中鉴定到一个与 VmEXLX1 互作的受体激酶 NbSRLK1。瞬时表达NbSRLK1 可以诱导细胞死亡、ROS 积累和胼胝质沉积，且NbSRLK1促进VmEXLX1的降解，而VmEXLX1促进NbSRLK1诱导的细胞死亡。 PR1-like蛋白VmPR1c被植物Skp1降解后激发免疫反应。三个PR1-like基因在病菌侵染早期都上调表达，其中VmPR1c敲除和过表达突变体的致病力都显著降低，且在本氏烟中瞬时表达可诱导细胞死亡、ROS 积累和胼胝质沉积，表明VmPR1c被植物识别并激发免疫反应。通过删除突变和western blot分析发现， VmPR1c诱导的细胞死亡需要翻译后修饰；信号肽缺失则不能诱导细胞死亡，信号肽切割位点附近的插入或删除突变均可影响蛋白的降解、翻译后修饰和诱导细胞死亡的能力。蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理，都不能有效抑制 VmPR1c 的降解；进一步的删除和点突变分析发现，CAP功能域中的3个α螺旋区域单独都能介导GFP融合蛋白的降解，而NTE和CTE功能域中的脯氨酸则起保护蛋白的作用。亚细胞定位试验表明，VmPR1c定位于植物的细胞质和细胞核。通过酵母双杂交筛选及双分子荧光互补验证，鉴定到一个苹果的互作蛋白MdSkp1。瞬时表达分析发现，MdSkp1可以显著促进VmPR1c的降解及其诱导的细胞死亡，并且VmPR1c不能在沉默NbSkp1的本氏烟中诱导细胞死亡，表明Skp1识别并介导了VmPR1c诱导的细胞死亡。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1植物病原真菌基因组研究进展

1.2基因水平转移（Horizontal Gene Transfer, HGT）

1.3微生物的扩张蛋白类似物（expansin-like protein）

1.4病程相关蛋白1类似物（PR1-like protein）

1.5植物识别病原菌的入侵模型（Invasion Model）

1.6苹果树腐烂病及其病菌生物学的研究进展

1.7本研究的目的和意义

第二章 苹果树腐烂病菌的基因组测序分析

2.1引言

2.2材料和方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第三章 Expansin-like蛋白VmEXLX1被植物识别的机制

3.1引言

3.2材料和方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章 VmPR1c被植物Skp1降解后激发免疫反应

4.1引言

4.2材料和方法

4.3结果与分析

4.3讨论

第五章 结论及展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

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