苦荞ABC转运蛋白基因的克隆与功能初步分析

摘要

ATP 结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白属于膜整合蛋白超家族，遍布于原核和真核生物中，借助水解ATP得到的能量运输底物分子进出胞内外实现功能。动物中的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是起先得到学者普遍关注的ABC转运蛋白类型。研究证实在植物中，外源物质、植物激素、金属离子、脂类和次级代谢物是ABC转运蛋白的主要转运底物。本研究首先对铅处理下苦荞种子萌发实验和盆栽实验中苦荞叶片的生理形态指标进行分析，并依据铅处理环境下的苦荞叶片转录组数据，通过实时定量验证重金属铅处理条件下差异表达ABC转运蛋白基因（FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15）表达特征，通过RT-PCR克隆表达存在差异的苦荞ABC转运蛋白基因的开放阅读框，并对基因序列进行生物学分析；构建基于pYES2的酵母表达载体，在重金属敏感酿酒酵母突变菌株ycf1中验证各ABC转运蛋白的功能；构建基于pCAMBIA3301的植物表达载体，在拟南芥中进行过量表达，研究为深入阐释ABC转运蛋白在苦荞植物重金属富集和解毒中的机理提供基础。本研究得到的主要结论有： （1）在0mg/L-1600mg/L的硝酸铅浓度范围内，铅处理对苦荞种子的发芽率无明显影响；在0g/kg-15g/kg的硝酸铅浓度范围内，铅处理对植株的生长发育无明显影响，但对苦荞萌发期胚根伸长和成株期的株高有抑制作用；铅处理导致苦荞叶片部位游离脯氨酸含量降低，诱导丙二醛含量、可溶性蛋白含量和的可溶性糖含量（还原糖除外）显著增加，随着铅浓度的增加，SOD和CAT活性先升高后降低，这些指标变化表明在一定浓度铅处理下苦荞叶片生物膜系统受到伤害，但苦荞良好的生理基础使其能在低铅浓度下应对胁迫。苦荞生物量大，生长周期短，较好的耐铅性使其成为有潜力可开发的生物修复植物。 （2）转录组数据分析显示，FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15在重金属胁迫条件下表达上调；实时定量分析表明FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15均在叶片中表达最高，分别为根的4.9、23.6和3.5倍。而FtABCB1在根、茎和叶中的表达相近。在铅处理下定量分析表明，4个基因在根，茎和叶中均有上调，其中，在硝酸铅为10g/kg土和15g/kg土的处理根中，FtABCC9和FtABCG11上调最多，分别是对照的7.7和3.9倍。而在10g/kg土的硝酸铅处理叶中，FtABCG15和FtABCB1上调最多，分别是对照的6倍、3.7倍，表明不同ABC基因组织表达特性及对铅胁迫的响应存在差异。 （3）苦荞ABC转运蛋白基因FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15的编码序列分别为4047bp、4476bp、2121bp和2061bp，分别编码147.3kDa、166.6kDa、78kDa和76kDa的蛋白。氨基酸分析显示其含有ABC转运蛋白典型的WalkerA基序、WalkerB 基序以及ABC特征基序。跨膜结构分析表明FtABCB1和FtABCC9为正向全分子ABC转运蛋白，FtABCG11和FtABCG15为反向半分子ABC转运蛋白。 （4）在重金属敏感酿酒酵母ycf1的功能互补显示在初始接菌量相同的条件下，实验组转化pYES2-FtABCB1、pYES2-FtABCG11和pYES2-FtABCG15的酵母生长速度明显较对照组转化空载体pYES2的酵母缓慢。推测ABC转运蛋白对酵母产生细胞毒性从而抑制其生长，因而该表达系统可能不适合来验证ABC基因的功能。 （5）构建融合GFP的植物表达载体，通过洋葱表皮亚细胞定位实验表明FtABCB1、FtABCC9、FtABCG11和FtABCG15可能均位于细胞质膜。分别获得转基因FtABCG11和FtABCB1的T0代、转基因FtABCG15的T2代拟南芥阳性植株，为深入研究苦荞ABC转运蛋白基因的重金属抗性功能奠定基础。

目录

第一章 文献综述

1.1苦荞简介

1.2 ABC转运蛋白研究进展

1.3土壤重金属污染

1.4植物修复原理

1.5 ABC转运蛋白的重金属解毒机制

1.6 研究目的与意义

第二章 苦荞对铅胁迫的耐性分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 苦荞ABC转运蛋白基因的克隆与生物信息学分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 苦荞ABC转运蛋白基因的亚细胞定位和功能验证

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

缩略词

致谢

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