牛小腔卵泡体外培养体系二维法和三维法的比较

摘要

哺乳动物卵巢含有大量腔前卵泡和小腔卵泡，只有少数卵泡能够继续生长发育并排卵，其余卵泡在生长过程中逐渐发生闭锁，如何体外增加腔前卵泡和小腔卵泡的利用率一直是科学研究的热点。目前，腔前卵泡经体外培养已经可以形成卵泡腔，但成腔后的卵泡体外培养鲜有研究，体外培养方法还不完善。本实验采用腔前卵泡最常用的二维微孔板法和三维海藻酸盐水凝胶法对牛小腔卵泡进行体外培养研究，目的是建立一种理想的牛小腔卵泡体外培养体系，为牛卵泡发育研究以及牛小腔卵泡的开发利用奠定基础。 1、体外培养牛小腔卵泡的筛选 利用显微机械分离法分离牛卵巢卵泡。在倒置显微镜下，根据卵泡形态特征初步将卵泡分为3类。通过分析各类卵泡的激素表达水平、颗粒细胞和内膜细胞的成活率以及卵母细胞质量等判断卵泡的质量。结果显示：I类卵泡内颗粒细胞存活率为92.5±7.5%，卵母细胞存活率为81.78±6.2%，雌二醇(E2)表达量明显高于其他类型卵泡，孕酮(P4)表达量明显低于其他类型卵泡；II类卵泡内颗粒细胞存活率为79.75±5.7%，卵母细胞存活率为37.61±4.6%，E2表达量低于I类卵泡；III类卵泡内颗粒细胞成活率为45.70±6.45%，卵母细胞存活率为0.00，其E2的表达水平明显低于第I、II类卵泡，P4表达量明显高于其他类型卵泡。 2、牛小腔卵泡体外培养体系二维法和三维法的比较 通过对比二维微孔板法和三维海藻酸盐凝胶法体外培养牛小腔卵泡（直径≤1.5mm）生长形态、卵母细胞存活率和激素表达水平之间的差异，判断两种体外培养方法的优劣势。该实验利用显微机械分离法从牛卵巢中分离直径在700-800μm之间的卵泡，然后通过二维法和三维法在含有800μl培养基的48孔板中培养在8天。每隔两天对卵泡进行一次直径测量、存活鉴定及培养液内类固醇激素分泌量检测。培养第8天时，收集卵母细胞并判断其质量。结果显示，在牛小腔卵泡培养0-4天时，卵泡类固醇激素表达水平、存活状态及卵母细胞存活率在两个体系中无显著差异，二维法卵泡的生长速率较三维卵泡快。培养4天以后，与二维体系相比，三维体系内卵泡的存活率、直径增长率和E2浓度均高于二维体系，P4浓度则低于二维体系。培养8天时，三维海藻酸盐凝胶培养体系中卵泡的卵母细胞存活率(19.3±3.5%)明显高于二维培养体系培养的卵泡(0.00%)(P＜0.05)。 结论：1、第一类卵泡颗粒细胞成活率、雌二醇的表达量以及卵母细胞的存活率明显高于其他类型卵泡，孕酮表达量明显低于其他类型卵泡，是体外培养的最佳选择。2、若牛小腔卵泡体外培养时间为4天以内，两种培养方法下卵泡的类固醇激素表达能力、存活状态以及卵母细胞存活率之间差异不显著。若牛小腔卵泡体外培养时间为4天以上，三维法培养可以更好更长时间的维持牛小腔卵泡存活、生长及激素分泌。

目录

第一章 哺乳动物卵泡的研究进展

1.1 哺乳动物卵泡发育

1.2 哺乳动物卵泡的闭锁

第二章 哺乳动物卵泡体外分离及培养的研究进展

2.1 哺乳动物卵泡分离方法研究进展

2.2 哺乳动物卵泡体外培养的研究进展

第三章 体外培养牛小腔卵泡的筛选

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 牛小腔卵泡体外培养体系二维法和三维法的比较

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

结论

创新点和后续研究的主要课题

创新点

后续研究的主要问题

参考文献

缩略词表

致谢

作者简介