马铃薯卷叶病毒、S病毒与马铃薯纺锤形块茎类病毒的茎尖超低温保存研究

摘要

植物病毒和类病毒保存是病毒抗原制备、疫苗生产、检疫检验等病毒相关研究和应用的基本要求。本研究以感染马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus, PLRV）、马铃薯S病毒（Potato virus S, PVS）、马铃薯纺锤形块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid, PSTVd）的马铃薯品种‘紫花白’试管苗为材料，通过茎尖超低温保存马铃薯病毒和类病毒。获得主要研究结果如下： 1. 以单一感染PLRV、PVS、PSTVd及复合感染PLRV+PVS的试管苗为材料，利用小滴玻璃化超低温保存茎尖。不同带毒状况的茎尖均能成活、再生植株。 2. 对超低温保存后的再生苗继代培养12周后，用DAS-ELISA和RT-PCR进行带毒状况检测，结果表明，在单感PLRV和复合感染PLRV+PVS的再生试管苗中能检测到PLRV，PLRV的保存率为50%；在单感PVS和复合感染PLRV+PVS的再生试管苗中能检测到PVS，保存率均为100%；在单感PSTVd的再生试管苗中能检测到PSTVd，保存率为100%。保存后的PLRV、PVS和PSTVd均能通过嫁接感染无毒砧木。保存后的PVS和PSTVd能通过摩擦接种到无毒植株上。 3. 对成活细胞在超低温保存后的茎尖中的组织学观察表明，超低温保存后，大部分叶原基细胞受损，成活细胞大多位于茎尖的顶端分生组织、第1-3叶原基以及部分第4叶原基细胞中。免疫化学组织法对病毒在茎尖中的定位表明，PLRV不能侵染顶端分生组织和第1-3片叶原基，能侵染第4及其它叶原基。这样，超低温保存后有部分植株仍然是带毒PLRV的。前人的研究表明，PVS和PSTVd能侵染顶端分生组织和幼嫩的叶原基，因而再生植株的带毒率会明显高于PLRV. 本研究首次利用茎尖超低温保存马铃薯病毒与类病毒，为长期、高效保存病毒和类病毒提供了技术平台。

目录

第一章 文献综述

1.1 马铃薯卷叶病毒、S病毒及纺锤形块茎类病毒介绍

1.2植物病毒的保存

1.2.1冷冻法

1.2.2 冷冻干燥法

1.2.3物理化学脱水法

1.2.4组织培养保存法

1.2.5病毒的超低温保存

1.3茎尖超低温保存病毒

1.3.1什么是超低温保存

1.3.2茎尖超低温保存病毒的设想

1.4本研究的目的和意义

第二章 茎尖超低温保存马铃薯病毒与类病毒

2.1 试验材料

2.2主要试剂

2.3主要设备

2.4 试验方法

2.4.1 RT-PCR检测母株材料的带毒状况

2.4.2 小滴玻璃化茎尖超低温保存病毒

2.4.3组织学观察成活细胞

2.4.4免疫组织化学法定位病毒

2.4.5双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）

2.4.6 超低温保存病毒侵染力检测

2.4.7实时荧光定量对病原体的检测

2.4.8试验设计与数据分析

第三章 结果与分析

3.1.‘紫花白’试管苗病原体情况检测结果

3.2超低温保存病毒体系建立与优化（关键因素对病毒保存的影响）

3.2.1 PVS2处理时间对超低温保存PLRV的影响

3.2.2茎尖大小对超低温保存PLRV的影响

3.3茎尖超低温保存植物病毒的机理研究

3.3.1免疫组织化学法定位病毒

3.3.2茎尖组织学观察茎尖成活细胞分布

3.4超低温保存病毒、类病毒的结果

3.4.1不同带毒材料再生生长情况

3.4.2 不同带毒材料经超低温保存后的再生情况及病毒保存效率

3.5病原体超低温保存效果评估

3.5.1 qRT-PCR检测超低温保存病原体效率

3.5.2 DAS-ELISA检测超低温保存病原体效率

3.5.3 嫁接传毒

3.5.4摩擦传毒

第四章 讨论与结论

第五章 创新点

参考文献

缩略词

致谢

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