基于新型生物探针的盐酸克伦特罗的免疫学检测方法研究

摘要

随着社会的发展和科技的进步，食品安全问题频繁爆发，已经对公共健康构成严重威胁。灵敏并且可靠的分析方法在保障食品安全中扮演着重要的角色。免疫学检测是基于抗原抗体的特异性反应建立起来的分析方法，具有良好的特异性和选择性，已被广泛用于食品安全检测。本论文以禁用兽药盐酸克伦特罗（俗称“瘦肉精”）为检测对象，制备了鼠源单克隆抗体，并分别构建了两种免疫学分析方法：免疫层析试纸条和酶联免疫试剂盒，实现了饲料、牛奶、猪尿中盐酸克伦特罗的灵敏和可靠的检测。本论文的研究成果如下： 1、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备：用人工抗原即市售盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白的偶联物（CL-BSA）免疫六周龄的雌性 BALB/c 小鼠，诱导小鼠产生克伦特罗的抗血清。免疫进行四次后，抗血清效价达到最高且稳定，取小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到的杂交瘤细胞用有限稀释法得到单克隆。通过间接 ELISA和间接竞争ELISA筛选出三株高特异性且具有良好竞争效果的杂交瘤细胞，其中9A8细胞株的细胞培养液效价达到 1:1600，腹水效价达到 1:256000，该抗体的灵敏度（以 IC50表示）为1.25 ng/mL，与其他结构类似物的交叉反应小于0.08 %，对盐酸克伦特罗有较强的特异性。 2、基于新型生物探针的高灵敏度免疫层析试纸条的构建及性能鉴定：本研究开发了一种以细菌作为信号载体的新型生物探针。细菌可以在其表面上负载大量的金纳米颗粒（AuNPs）实现信号放大，并标记极少量的抗体，引发游离分析物与固定化抗原之间的激烈竞争从而显著提高了灵敏度。通过优化分析条件，包括细菌种类、偶联方法和探针浓度比例，分析性能达到最佳效果，对盐酸克伦特罗的视觉检出限（VDL）为 0.1 ng/mL。相比于传统的基于纳米金标记抗体探针的试纸条，灵敏度提高了20倍。该分析平台具有良好的特异性和稳定性，并成功用于饲料、牛奶和猪尿液的检测，灵敏度分别为0.2 ng/g，0.5 ng/mL和0.1 ng/mL。这项工作为免疫层析试纸条的信号放大和性能改善开辟了一条新途径。而且，灭活的细菌可以成为杰出的信号载体用于更多的生物传感器。 3、基于新型生物探针的高灵敏度酶联免疫试剂盒（ELISA）的构建及性能鉴定：基于上一章节的基础，引入细菌作为天然有机载体构建探针。通过细菌载体，信号分子与识别分子之间的比例被灵活地调节，实现辣根过氧化物酶（HRP）的富集和抗体的限量。在该方案中，富集的酶通过催化底物显色反应增强了信号，极少量的抗体引发游离小分子目标物和固定化抗原之间的激烈竞争而改善灵敏度。基于这一原理构建了酶联免疫试剂盒并优化了参数，包括酶与抗体的比例和反应条件。在最佳条件下对盐酸克伦特 罗分析的线性范围为0.02-1 ng /mL，线性方程：y=-0.542x+2.6826，R2=0.9957，通过竞争抑制曲线确定IC50为0.5 ng/mL，检测限（LOD）为0.02 ng/mL。该试剂盒不受其他结构类似物的干扰，并用于饲料、牛奶和猪尿的检测，充分展现了该传感器具有良好的灵敏性、稳定性、特异性和实用性。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1盐酸克伦特罗

1.2检测方法

1.3免疫学检测

1.4研究内容及目的意义

1.5技术路线

第二章 盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及鉴定

2.1试验材料

2.2试验方法

2.3结果与讨论

2.4小结

第三章 基于新型生物探针的免疫层析试纸条的制备及性能评价

3.1试验材料

3.2试验方法

3.3结果与讨论

3.4小结

第四章 基于新型生物探针的酶联免疫试剂盒的制备及性能评价

4.1试验材料

4.2试验方法

4.3结果与讨论

4.4小结

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

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