维甲酸诱导的miR-219上调促进小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化

摘要

维甲酸能够以浓度依赖性的方式在体外诱导多种细胞，通过激活miRNA然后抑制干细胞因子的方式，促进干细胞向神经系统发育和神经元分化。microRNA在维甲酸介导的胚胎干细胞分化过程中有着很重要的作用，一般是通过抑制靶基因的翻译调控下游基因的表达。那么miRNA作用的靶基因是如何调控胚胎干细胞向神经细胞分化的作用机制还没有具体的研究。 在前期的实验中，我们发现,维甲酸诱导小鼠J1胚胎干细胞定向分化的过程中，关键对象是一种microRNA，miRNA-219，以及其下游靶基因。然后我们通过在本研究中，发现通过定量PCR和western blot实验，证明了miR-219可以通过靶向Foxj3和Zbtb18来参与ES细胞向神经的分化过程，在RA诱导的条件下对分化过程起到一个抑制性的作用。 在确定了靶基因的基础上，我们通过构建能稳定过表达靶基因的Foxj3-ESCs和Zbtb18-ESCs两株细胞，提取总RNA后通过构建文库和高通量测序，为Foxj3和Zbtb18构建了基因共表达网络，并且发现在其中有17个核心基因的功能是和神经发育密切相关的。通过实时定量PCR，我们发现在这基因中有16个基因在参与神经分化的过程中表达量是升高的。 随后我们这些基因中筛选出了四个差异度最大的基因Olig1、Zic5、 Erbb2和Olig2，通过对RA和miR-219作用的ES细胞进行定量PCR和Western blot，以及对干细胞标记基因Oct4、Nestin、Map2等的表达进行检测，证明了Olig1和Olig2可能是ESCs神经分化中最重要的因素。 最后，我们通过对Olig1/2进行敲降，在ES细胞经过RA和miR-219处理后，通过定量PCR和Western blot对几种干细胞进行标记基因检测，发现由于ES细胞缺乏神经细胞标志物Map2和Tuj1表达，使ES细胞未能分化为神经细胞，。 总之，本实验首次发现了在维甲酸诱导的条件下，miR-219的靶向Foxj3和Zbtb18通过作用于下游的Olig1、Zic5、Erbb2和Olig2基因，实现对小鼠胚胎干细胞向神经分化过程的调控，这一结果从基因互作网络的角度在在miRNAs的基础上，对于miR-219在神经发育中，诱导胚胎干线向神经分化的机制提供了分子机理，为小鼠microRNA在神经分化研究和功能网络的应用提供了指导。

目录

声明

第一章 维甲酸和microRNA在胚胎干细胞作用中的研究

1.1引言

1.2 胚胎干细胞的研究进展

1.3胚胎干细胞体外诱导定向分化的机制研究

1.4 维甲酸的研究进展

1.5 miRNA的研究进展

第二章 Foxj3和Zbtb18调节ES细胞向神经分化

2.1 前言

2.2 实验材料

2.4 实验结果

2.5讨论

2.6 小结

第三章 miR-219-Foxj3/Zbtb18差异表达基因

3.1 引言

3.2 实验仪器与材料

3.3 试验方法

3.4 实验结果

3.5讨论

3.6小结

第四章Olig1和Olig2功能的鉴定

4.1 引言

4.2 实验仪器与材料

4.3 试验方法

4.5 讨论

4.6 小结

全文总结

参考文献

致谢

作者简介