甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S细胞学观察及转录组分析

摘要

油菜温敏细胞核雄性不育（TGMS）SP2S是一个自然突变，在两系杂交油菜育种中具有实用价值。本文利用细胞学观察、转录组拼接序列比较、转录组表达差异比较、基因表达定量PCR等方法，对SP2S及其近等基因系SP2F进行综合研究，为揭示SP2S响应温度变化的转录调节提供基础并揭示与TGMS表达相关的关键细胞活动和基因调控。 结果表明： 1、SP2S花药中小孢子母细胞减数分裂不同步，绒毡层质体和造油体异常。在细胞质降解前四分体小孢子不进行有丝分裂。四分体壁的延迟降解，不仅导致四分体小孢子的聚集，还导致四分体外层（花粉外壁外层）形成延迟和外壁的融合，花粉壳内壁（外壁基层）也消失不见。四分体壁延迟降解和外壁结构的异常表明有缺陷的绒毡层失去重要功能。 2、用Illumina Solexa平台对SP2S、SP2F在高温、低温下处理幼嫩花蕾的4组mRNA进行高通量测序，总计得到2.397亿个短reads，总长19.95 Gbp。用Trinity程序进行从头拼接，组装产生135,702个转录本，总长度107Mbp，平均长度为784bp，N50值1221bp。全部的转录本序列已经提交保存在NCBI转录组鸟枪法组装（TSA）数据库（登录号GDFQ00000000）中。组装的转录本cDNA中有24,157个简单重复序列。比较不同温度（16℃和22℃）下的SP2S及同一温度（22℃）下的SP2F和SP2S，发现分别有137和195个单核苷酸多态性（SNP）。这些众多差异表达基因和SNPs表明TGMS转录调节异常行为比较复杂。这个全转录组拼接中，约86.9%序列与NCBI数据库油菜基因匹配，但目前其中大部分基因功能未知，所以该转录组序列信息是对NCBI数据库所有油菜基因及功能注释有益的补充，并对我们随后所做的多个油菜转录组测序方案中基因识别提供重要参考。 3、用Illumina数字化基因表达谱这种简化转录组测序策略，对SP2S和SP2F幼嫩花蕾之间做3重复转录组学比较，共鉴定出465个差异表达基因（DETs），其中303个上调，162个下调。编码微小RNA核酸降解酶2、α同工型丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶2A、小RNA 2’-邻-甲基转移酶、转录因子bhlh25、硫氧化还原蛋白还原酶2、富亮氨酸重复受体蛋白激酶At3g14840 like、富甘氨酸蛋白1A和成束阿拉伯半乳聚糖蛋白FLA19与FLA20等的基因在SP2S中表达量明显下降。有意思的是，编码拟南芥MS5同源蛋白质的POLLENLESS3-LIKE2基因在SP2S中下调，它是小孢子母细胞减数分裂必不可少的基因，其与COI1基因的序列在SP2F和SP2S中存在明显差异。SP2S中其它上调基因还包括编码葡聚糖酶的A6、乙烯响应转录因子1A-like、花粉特异性蛋白SF3、胁迫相关的内质网蛋白质2、WRKY转录因子和三角状五肽重复内含蛋白（PPR）At1g07590等。在SP2S中影响胼胝质降解和外壁形成的下游基因BNMS1和BnMYB80则明显上调。这种异常的遗传调控与细胞学观察结果异常相吻合。根据这些证据，初步构建了SP2S育性调控的模式图。

目录

第一章 文献综述

1.1 油菜杂种优势的利用

1.2 光温敏雄性不育的相关研究

1.3 油菜转录组研究进展

1.4 本研究的目的和意义

第二章 SP2S细胞学特征观察

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 油菜温敏雄性核不育系SP2S从头拼接转录组测序

3.1 材料和方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 SP2S花蕾转录组差异比较及基因表达量分析及相关基因克隆

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

缩略词

致谢

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