PBPm-MDCC ATPase活力检测体系的建立与优化以及在Pif1解旋酶中的应用

摘要

ATPase 活力是衡量很多蛋白质尤其是细胞代谢相关酶活力的重要指标，有效的ATPase活力测定方法在分子生物学研究中是必不可少地。可以通过直接检测溶液中ATP浓度的变化或者通过测定水解ATP后产生Pi浓度的变化来计算酶的ATPase活力，在后一种测定方法中，较成熟的一种方案是构建PBPm-MDCC ATPase活力测定体系。其基本思路是将荧光标记了的周质磷酸结合蛋白（PBPm）作为探针，通过检测PBPm与Pi结合后构象发生变化而引起荧光信号变化的特性检测 ATP 水解释放的 Pi，从而实现ATPase活力的测定。这种方法建立于1994年，灵敏度高且能实现实时检测，经过二十多年的完善和优化已逐渐成为分子生物学领域检测ATPase活力的重要方法之一。 PBPm-MDCC ATPase活力测定体系的成功构建主要取决于三个方面：PBPm蛋白和嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）经济高效的获取；荧光染料MDCC标记PBPm蛋白及标记后的分离纯化；ATPase活力测定体系中游离无机Pi的去除。以往研究中：PBPm蛋白和PNPase蛋白表达纯化方法繁琐，费时费力；使用荧光染料MDCC标记PBPm蛋白后不能将构型正确的标记产物有效分离，标记和纯化效率较低；另外，没有将 ATPase活力测定体系中游离的无机 Pi有效去除，测定时的背景值和误差较大。本研究旨在开发高效实用的PBPm蛋白和PNPase蛋白的表达与纯化方法，摸索MDCC标记PBPm蛋白以及标记产物的高效纯化方案，利用PBPm-MDCC和Pi-mop构建ATPase活力测定体系，并在ScPif1解旋酶ATPase活力检测实验中验证其可行性，以期将PBPm-MDCC ATPase活力测定方法优化的更加简便高效。本研究主要取得了以下结果： （1） 从大肠杆菌基因组DNA中成功克隆PBPm(A197C)单突变和PBPm(A17C/A197C)双突变基因（PhoS），并将其连入pET15b-SUMO表达载体，通过优化表达条件和纯化方案，最终每升培养菌液可得到135 mg以上纯度高于98%不带任何标签的 PBPm 蛋白，与文献报道相比，消除了 N-端标签对蛋白标记和折叠的影响，产量更多纯度更高且更加节省材料和时间。 （2） 从大肠杆菌基因组DNA中成功克隆到PNPase基因（deoD），并构建大肠杆菌表达载体pET15b-PNPase，经IPTG诱导表达后只用HisTrap HP 柱一步纯化，每升培养菌液就能得到170 mg以上纯度高于95%的高活性PNPase蛋白，表达纯化方法简便高效。 （3） 摸索出荧光染料 MDCC 成功标记 PBPm(A197C)蛋白的体系条件，并通过Superdex 200层析柱和HiTrap Q柱高效纯化到对无机Pi有响应的PBPm(A197C)-MDCC探针。 （4） 利用 PNPase 蛋白搭配 7—甲基鸟苷成功构建磷拖把（Pi-mop）体系，有效去除PBPm-MDCC检测体系中游离的无机Pi，提高了检测体系的灵敏度；并利用酶标仪和荧光分光光度计完成了 PBPm-MDCC 检测体系对 Pi 响应测试，得出PBPm-MDCC检测体系的荧光强度随Pi变化的标准曲线。 （5） 使用表达载体pET-28a在Rosetta菌株中成功表达解旋酶ScPif1，得到了纯度在95%以上的ScPif1蛋白，利用动态光散射分析发现其在溶液中主要以单体的形式存在且均一性良好。 （6）将本研究构建的PBPm-MDCC ATPase活力检测体系成功应用于ScPif1解旋酶ATPase活力测定实验，并比较了ScPif1在四种NTPs下的DNA解旋活力。实验证明了该体系具有很高的实用性，能作为一种更加简便高效的 ATPase 活力检测方法，为分子生物学NTPs相关研究提供帮助。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 周质磷酸结合蛋白（PBP）

1.2嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）

1.3 PBPm-MDCC ATPase活力检测体系

1.4 解旋酶综述

1.5 ScPif1解旋酶

1.6 研究目的与意义

第二章 PBP突变体基因的克隆、表达与纯化

2.1 实验材料和仪器

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 实验小结

第三章 PNPase基因的克隆、表达与纯化

3.1实验材料和仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 实验小结

第四章PBPm-MDCC ATPase活力检测体系的建立

4.1 实验材料和仪器

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 实验小结

第五章 PBPm-MDCC检测体系在ScPif1解旋酶ATPase活力测定中的应用

5.1 实验材料和仪器

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 实验小结

第六章 结论与创新点

6.1 结论

6.2 创新点

参考文献

附录

缩略词

致谢

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