丹参SmJAZ8蛋白互作转录因子的筛选及鉴定

摘要

丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)是一种唇形科鼠尾草属多年生草本植物，其干燥根及茎作为我国传统药材已经广泛应用于冠心病、慢性肾功能衰竭、动脉硬化等疾病的预防和治疗。本研究以SmJAZ8作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交筛选与其互作的转录因子，为后续探讨JASMONATE ZIM-DOMINE(JAZ)蛋白与转录因子互作调控丹参酮类和酚酸类物质合成的作用奠定基础。 本研究取得以下研究结果： 1.通过获得丹参各组织器官总RNA进一步制备了丹参全长均一化AD文库?本研究所构建的酵母文库的滴度大于1×107cfu/mL，酵母文库库容为3.1×107cfu/mL，平均插入片段大于1.0kb。 2.以BD-SmJAZ8为诱饵载体，酵母双杂交筛选酵母AD(均一化)文库，获得289个克隆?其中一个标号为8-6的克隆通过BLASTX分析表明是一个bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子，将其命名为SmbHLH128。 3.通过双分子荧光互补技术(BiFC)验证SmJAZ8与筛选到的转录因子SmbHLH128确实存在互作关系。随后截短SmJAZ8结构域，通过酵母双杂交验证了SmbHLH128与SmJAZ8的相互作用区域在SmJAZ8蛋白的Jas结构域。 4.验证SmJAZ8互作转录因子SmbHLH128的转录激活结构域在其转录激活结构域(TAD，Transcriptional Activation Domain)。构建SmbHLH128转录因子基因过表达载体和显性抑制SRDX表达载体，获得过表达转基因毛状根株系10个，显性抑制表达毛状根株系11个。通过荧光显微镜鉴定和qPCR分析确定转基因阳性毛状根的获得。

目录

第一章文献综述

1.1中药丹参成分分析

1.2茉莉酸信号通路研究进展

1.3茉莉酸调控丹参酮类和酚酸类物质合成研究进展

1.4转录因子调控丹参酮类和酚酸类物质研究进展

1.5研究目的和意义

1.6.1研究内容

1.6.2技术路线

第二章 酵母均一化cDNA文库的构建

2.1.1实验材料

2.1.2菌株与质粒载体

2.1.3试剂和工具酶

2.2实验方法

2.2.1 RNA抽提及质检

2.2.2 dscDNA的合成纯化

2.2.3 cDNA文库滴度和重组效率的检测

2.3.1总RNA的提取和全长cDNA的合成

2.3.2均一化效果检测

2.3.3文库鉴定

2.4讨论

第三章酵母双杂交筛选SmJAZ8互作蛋白

3.1实验材料

3.2.2构建pDEST-pGBKT7-SmJAZ8

3.2.3转化Y2HGold菌种验证自激活

3.2.4诱饵蛋白pDEST-pGADT7-SmJAZ8互作转录因子的筛选

3.3.1构建SmJAZ8的酵母表达载体

3.3.2 诱饵质粒pDEST-pGADT7-SmJAZ8自激活及蛋白互作转录因子的筛选

3.3.3 bHLH转录因子生物信息学分析

3.4讨论

第四章SmJAZ8和SmbHLH128互作模式分析

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1本氏烟草的种植

4.2.2构建荧光表达载体

4.2.3双分子荧光互补表达载体转化农杆菌

4.2.4双分子荧光互补表达载体在烟草叶片中的表达

4.2.5 Y2H分析SmJAZ8和SmbHLH128互作结构域

4.3.1 BiFC验证SmJAZ8和SmbHLH128互作关系

4.3.2 Y2H分析SmJAZ8和SmbHLH128互作结构域

4.4讨论

第五章SmbHLH128过表达和显性抑制技术转基因毛状根的获得和鉴定

5.1实验材料

5.1.1植物材料

5.1.2实验试剂

5.2实验方法

5.2.1 SmbHLH128去除自激活结构域

5.2.2构建过表达载体和SRDX抑制表达载体

5.2.4转基因毛状根株系分子水平检测

5.3实验结果

5.3.1 SmbHLH128去除自激活结构域

5.3.2转基因毛状根的获得与检测

5.3.3转基因毛状根株系分子水平检测

5.4讨论

第六章结论与展望

参考文献

附录

致谢

个人简历