苹果MdbZIP26基因表达模式及其启动子的功能分析

摘要

苹果在我国水果产业中占据重要地位，但在其生长过程中不可避免的受到干旱和盐胁迫等逆境因素的影响。据报道，bZIP家族转录因子与非生物胁迫密切相关。课题组前期已对苹果MdbZIP26基因进行初步功能研究，结果表明该基因可能通过ABA介导的信号转导途径来提高植物对干旱和盐胁迫的抗性。为了进一步阐明MdbZIP26基因的功能以及对非生物胁迫的响应机制。本文对MdbZIP26基因进行亚细胞定位和自激活活性验证，对其转录后潜在的磷酸化修饰位点进行预测分析。利用实时定量PCR法分析MdbZIP26的组织表达模式。同时，从富士苹果叶片中分离MdbZIP26基因启动子，将其与pCanbia1391Z-GUS载体连接后遗传转化拟南芥植株，进一步分析MdbZIP26在时间和空间上的表达模式。此外，利用生物信息学技术分析MdbZIP26启动子区的顺式作用元件，并对MdbZIP26启动子进行缺失表达分析。 获得的主要结果如下： 1、MdbZIP26亚细胞定位结果表明MdbZIP26定位于细胞核中。酵母自激活活性验证结果显示MdbZIP26具有转录自激活活性，但其自激活活性能够被200ng/ml的AbA抑制。说明MdbZIP26具备转录因子的特性。 2、MdbZIP26基因在苹果中的组织表达模式分析表明MdbZIP26基因在苹果茎、叶、花、果实和种子中均有表达，其中，在种子中的表达量最高，而在茎中的表达量最低。 3、将MdbZIP26基因启动子稳定表达于拟南芥中，研究MdbZIP26基因的时空表达模式的结果表明，在不同的生长阶段，MdbZIP26启动子驱动GUS的表达也有所不同。正常条件下，在转基因拟南芥生长至2、5、7d时，分别于胚根和胚轴中呈现较低GUS组织染色活性，但在子叶中几乎观察不到GUS组织染色活性；在生长4d和3周时，转基因植株的各组织中均有微量的GUS表达；在成熟转基因拟南芥的花（花药除外）和果荚基部均表现较高的GUS活性。在胁迫和ABA处理后，各个生长时期的转基因拟南芥的GUS组织染色活性均较对照增强。其中，在子叶、根、叶维管组织和保卫细胞中的GUS活性被显著促进。 4、MdbZIP26基因的启动子生物信息学分析表明，MdbZIP26基因启动子区含有ABRE、G-box、DRE、GT1GMSCAM4等顺式作用元件，可能参与响应ABA和渗透胁迫。MdbZIP26基因启动子缺失表达结果表明，在-1314bp~-1061bp区的ABRE和DRE元件可能对干旱和ABA的响应起着关键作用。另外，在-1061bp~-766bp的盐响应元件可能主要参与盐胁迫的响应。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1.1 非生物胁迫对植物的影响

1.1.2植物响应非生物胁迫的信号转导

1.1.3 bZIP转录因子与非生物胁迫

1.2植物启动子的研究进展

1.2.1真核生物启动子的结构

1.2.2 启动子的类型

1.2.3 启动子的研究方法

1.2.4 bZIP家族基因启动子研究现状

1.3 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种和载体

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.1.5 引物

2.2 方法

2.2.1 RNA提取及cDNA的合成

2.2.2 基因组 DNA 提取

2.2.3 实时荧光定量 RT-PCR

2.2.4 MdbZIP26 基因亚细胞定位

2.2.5 MdbZIP26自激活验证及磷酸化位点预测

2.2.6 农杆菌介导 MdbZIP26 基因启动子转化拟南芥

2.2.7 MdbZIP26 基因启动子顺式作用元件预测分析

2.2.8 MdbZIP26 基因启动子缺失表达分析

2.2.9 非生物胁迫与 ABA 处理

2.2.10 GUS组织化学染色及荧光活性测定

第三章 结果与分析

3.1 MdbZIP26 基因亚细胞定位

3.1.1 MdbZIP26-GFP 表达载体的构建

3.1.2 MdbZIP26 基因亚细胞定位分析

3.2.1 MdbZIP26自激活载体构建

3.2.2 MdbZIP26 基因自激活活性鉴定

3.3 MdbZIP26基因转录后潜在磷酸化位点预测

3.4 MdbZIP26基因组织表达模式分析

3.5.1 proMdbZIP26-GUS表达载体的构建

3.5.2 proMdbZIP26-GUS转基因拟南芥株系筛选

3.5.3转基因拟南芥在不同生长阶段的表达分析

3.5.4不同生长阶段转基因拟南芥在不同处理下的表达分析

3.6 MdbZIP26 基因启动子生物信息学分析

3.7 MdbZIP26 基因启动子缺失瞬时表达分析

3.7.1 MdbZIP26 基因启动子缺失瞬时表达载体构建

3.7.2 MdbZIP26 基因启动子缺失表达分析

第四章 讨论

第五章 结论

附录

参考文献

致谢

个人简历