‘嘎啦’苹果MYB12和MYB16基因启动子的克隆与功能分析

摘要

基因表达与基因的启动子关系密切，探究基因启动子的表达特征，一定程度上有助于基因功能的挖掘。实验室已有的数据表明，对商业采收期‘嘎啦’苹果果实MYB12和MYB16基因沉默可延缓‘嘎啦’苹果果实采后成熟。为进一步探究‘嘎啦’苹果MYB12和MYB16基因潜在的功能，以PCR方法克隆‘嘎啦’苹果MYB12和MYB16基因的启动子并在番茄和拟南芥体内研究这两个启动子的表达特征。主要试验结果如下:
　　1.采用同源克隆方法从‘嘎啦’苹果体内克隆MYB基因启动子ProMdMYB12和ProMdMYB16，长度分别为1290 bp和984 bp。同源比对显示二者与参考序列的同源性分别达到99％和97％。PlantCARE和PLACE预测结果显示，基础顺式作用元件、组织特异性表达元件、激素响应元件、胁迫响应元件、MYB/MYC转录因子结合位点、大量的光响应元件以及其它类型的启动子顺式作用元件在ProMdMYB12或ProMdMYB16序列中均有发现。预测到的启动子顺式作用元件有助于对启动子的功能进行深入研究。
　　2.番茄体内瞬时表达ProMdMYB12和ProMdMYB16的GUS组织化学染色结果表明这两个启动子在番茄的花药和种子处具有较高的表达量，在番茄的果肉、叶片、花瓣、花萼和花梗等部位没有表达活性。GUS蛋白酶的荧光值定量结果与GUS组织化学染色结果一致，即转基因番茄的花和种子的荧光定量值较高而叶片和果肉的荧光定量值较低。选择ProMdMYB16浸染并经过GUS组织化学染色的番茄种子制作石蜡切片，研究启动子在番茄种子处的表达特征。结果表明ProMdMYB16能够驱动GUS基因在番茄种子的种皮毛表达。
　　3.试验获得12株ProMdMYB16转基因拟南芥。对ProMdMYB16转基因拟南芥各组织进行GUS组织化学染色。转基因拟南芥种子萌发初期GUS基因表达有两种模式。种子萌发第一天，株系2(L2) GUS表达的部位是在种子胚，第二天是在子叶、子叶与胚轴连接处，第五天位于子叶基部与叶柄连接处以及根部但不包括根尖。株系6(L6)，第一天没有GUS基因表达，第二天GUS活性出现在胚轴下部和胚根上部之间，第五天集中于根尖上部与胚轴靠下部分。幼苗发育到12天，各株系的GUS组织化学结果相似，即位于新生真叶的叶柄与顶端分生组织连接处、子叶主叶脉、根系节点和维管束组织等处。侧根分化出根尖前启动子在整个侧根发育组织都具有较高活性，侧根进一步发育，但ProMdMYB16始终不在根尖表达，而是在新生侧根的维管束有较高的表达。在营养器官，GUS组织化学染色主要是在托叶的主叶脉、茎叶基部和腋芽与茎的连接处。在生殖器官则集中在花粉粒。这些结果表明ProMdMYB16具有种子胚、花粉和根的组织表达特异性。
　　4.使用12天的转ProMdMYB16拟南芥幼苗研究启动子对激素和非生物胁迫的响应。研究发现，200mmM氯化钠、20％聚乙二醇6000、100μM脱落酸、1mM水杨酸或100μM赤霉素处理的幼苗与对照之间GUS组织化学染色结果没有明显差异，经42℃高温处理12h的幼苗新生真叶的叶柄与顶端分生组织连接处GUS表达活性增强，而经1OOμM茉莉酸甲酯(MeJ)处理的幼苗各个部位的GUS组织化学染色消失。激素和非生物胁迫处理的结果初步表明ProMdMYB16受高温诱导表达而外源MeJ会抑制启动子的表达活性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 MYB转录因子

1．2 启动子研究进展

1．3 课题研究背景与研究目的

第二章 ‘嘎啦’苹果MYB12和MYB16基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

2．1 材料

2．2 试验方法

2．3 试验结果

第三章 ‘嘎啦’苹果MYB12和MYB16基因启动子功能分析

3．1 材料

3．2 试验方法

3．3 试验结果

第四章 讨论与结论

参考文献

致谢

作者简介