BHD综合征因子FLCN调控氨基酸转运蛋白PAT1在细胞内定位的机制研究

摘要

BHD综合征(Birt-Hogg-Dubésyndrome)是由FLCN(folliculin)基因突变所引起的一种动物遗传疾病。现有证据表明FLCN蛋白参与了多种生物过程，包括信号转导、细胞粘附、溶酶体和线粒体的生物合成、细胞能量代谢和营养稳态等，但缺失FLCN导致BHD综合征的具体原因仍不清楚。通过对FLCN蛋白三维结构的研究发现其C末端具有一个DENN结构域，这一结果提示FLCN可能通过与某些Rab家族蛋白成员发生作用进而调控细胞内的囊泡运输过程。然而由于对被运输的货物分子尚缺乏了解，FLCN在囊泡运输中的具体功能还有待实验证实。 质子协同氨基酸转运蛋白1（proton-assisted amino acid transporter1,PAT1，又称SLC36A1）是一个在哺乳动物体内广泛分布的跨膜氨基酸转运蛋白。在多种类型的细胞里，PAT1主要定位在溶酶体表面，PAT1还可以定位在其它部位，包括细胞膜、伪足，神经细胞的轴突和突触小泡等。在大鼠平滑肌细胞，PAT1甚至定位在细胞核。这些结果说明PAT1的定位受多种机制调控，PAT1在不同细胞里执行的生理功能与其定位有关。本研究组的前期研究发现，在人胚胎肾细胞HEK293中，FLCN抑制PAT1定位在溶酶体：当FLCN的表达被抑制时，PAT1募集到溶酶体表面，促进将溶酶体内储存的氨基酸释放进入细胞质。由于溶酶体内的氨基酸是激活营养代谢关键调控因子mTORC1的一个重要信号，溶酶体内氨基酸浓度下降导致mTORC1活性降低。 在真核细胞里，膜蛋白在细胞内的定位主要通过囊泡运输来实现，推测PAT1可能是FLCN执行囊泡运输功能的一个货物分子。为了探索FLCN调控PAT1定位的机制，进而揭示FLCN在囊泡运输中的潜在功能，本研究以体外培养的HEK293细胞为主要研究模型，使用多种细胞生物学和生物化学技术，对PAT1在细胞内的运输途径以及FLCN调控PAT1定位的机制展开了深入研究，获得了如下主要发现： 1.PAT1在多种囊泡上都有定位。免疫荧光染色结果显示，PAT1与多种囊泡标记蛋白存在共定位，包括LAMP1（溶酶体）、Rab5A（早期内体）、EEA1（早期内体）、TGN38（反式高尔基体）、Chmp5（多囊体）、Rab7A（晚期内体）、M6PR（晚期内体和循环内体）、Rab11A（循环内体）等。其中，PAT1主要定位在溶酶体，PAT1与其它囊泡也存在不同程度的共定位，这些发现提示PAT1可以沿着内吞(endocytosis)和再循环途径(endocytic recylcing)在细胞内运输。 2.细胞内吞实验(internalization assay)显示位于细胞膜上的PAT1可以通过内吞进入细胞，并最终定位于溶酶体，说明PAT1可以通过间接运输方式被运输到溶酶体。3.FLCN抑制PAT1定位到溶酶体，促进PAT1定位到细胞膜，正向调控mTORC1。通过RNA干扰的方法抑制FLCN表达(FLCN-RNAi)，或者敲除FLCN基因(FLCN-/-)，导致PAT1的水平在溶酶体表面增多，在细胞膜上减少，细胞的mTORC1活性降低。缺乏氨基酸导致PAT1在溶酶体表面富集以及mTORC1活性下降；提高FLCN的表达量可以抑制PAT1在溶酶体募集，使细胞在氨基酸缺乏的情况下仍可维持较高水平的mTORC1活性。 4.FLCN与回收运输调节因子Rab11A存在相互作用。免疫共沉淀(co-IP)实验结果显示，FLCN可以结合Rab5A、7A、11A，但FLCN与Rab7A和Rab11A结合较强，与Rab5A的结合较弱；FLCN通过DENN结构域与Rab11A结合。 5.Rab11A抑制PAT1定位到溶酶体，促进PAT1定位到细胞膜，这与FLCN的作用一致。抑制Rab11A表达(Rab11A-RNAi)，或者过表达失活形式的Rab11A突变体(S25N)导致PAT1的水平在溶酶体表面增多，在细胞膜上减少，mTORC1活性下降；反之，过表达活性形式的Rab11A(Q70L)抑制PAT1定位到溶酶体，并缓解过表达PAT1对mTORC1的抑制作用。 6.体外GEF活性检测实验显示，FLCN不能直接调控Rab11A的活性，这与已有的报道一致。然而发现FLCN促进Rab11A与PAT1结合：在FLCN缺失的背景下，PAT1与Rab5A或Rab7A的结合不受影响，但PAT1与Rab11A的结合能力显著降低。 根据以上发现，尝试得出两个结论：（1）FLCN是Rab11A的一个效应因子，FLCN通过DENN结构域与Rab11A结合；（2）FLCN通过将PAT1与Rab11A绑定促进PAT1向细胞膜（或高尔基体）方向运输，因而抑制PAT1向溶酶体方向运输。本研究揭示出FLCN与Rab11A之间的一种关系，发现了FLCN在回收运输中的新功能，为进一步阐明BHD综合征的发病机理提供了新线索。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 FLCN研究进展

1.2氨基酸转运蛋白PAT1研究进展

1.3 Rab蛋白与囊泡运输

1.4 Rab11研究进展

1.5 前期研究发现及本研究设想

第二章 PAT1在HEK293细胞内的定位及运输途径

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 FLCN对PAT1细胞内分布的影响

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 FLCN与Rab11A存在蛋白与蛋白间相互作用

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 Rab11A调控PAT1在溶酶体和细胞膜上的定位

5.1 材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 FLCN在Rab11A介导的囊泡运输中的功能研究

6.1 材料

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

6.5 小结

第七章 结论

创新点

下一步研究计划

附录

缩略词

参考文献

致谢

个人简历