氨基酸转运蛋白PAT1在溶酶体定位机制及其对调控mTORC1的意义

摘要

mTORC1（mechanistic/mammalian target of rapamycin complex1）是一种进化上保守的蛋白激酶复合物，是细胞根据环境因素调节代谢水平的一种关键分子。异常的mTORC1调控与多种疾病的发生密切相关，因此解析mTORC1的调控机制具有重要意义。位于溶酶体内的氨基酸是激活mTORC1的一种重要信号分子，但溶酶体内氨基酸水平的调控机制尚缺乏研究。PAT1（proton-coupled amino acid transporter1）是一个11次跨膜的氨基酸转运蛋白，主要定位于溶酶体，可以通过降低溶酶体内的氨基酸水平来负向调控mTORC1。然而在某些类型的细胞中，PAT1也定位在内体，甚至细胞核中。目前PAT1在细胞内的定位机制还不清楚。前期研究发现，PAT1在溶酶体上的定位受到氨基酸水平的影响而呈现动态变化。 为了深入调查PAT1的定位调控机制，及其对调控mTORC1的意义，本项工作以人肾上皮细胞HEK293为主要研究模型，通过调查带有标签分子的PAT1融合蛋白在溶酶体的定位调控机制及其对mTORC1活性的影响，获得如下研究结果： 1.以EGFP-PAT1为研究对象，发现该融合蛋白在PAT1氨基端的47TTWF50位点发生剪切，导致PAT1失去位于氨基端的胞内区片段。 2.通过氨基酸序列分析，PAT1氨基端的胞内区包含一个经典的酪氨酸类型的溶酶体定位信号，38YQRF41（YxxΦ）。将关键的Y38位点突变为丙氨酸（Y38A），导致突变的PAT1在溶酶体上表达量降低，而在细胞膜上表达量升高，并且不能抑制mTORC1的活性。这些结果说明38YQRF41参与指导PAT1向溶酶体的运输。 3.当外界缺乏氨基酸时，PAT1的剪切被抑制。而氨基酸，或者单独的谷氨酰胺可以诱导PAT1发生剪切。氨基酸可以通过诱导PAT1剪切掉溶酶体定位信号来抑制PAT1定位于溶酶体，促进维持溶酶体内的氨基酸水平。 4.通过免疫荧光染色的方法，分析了PAT1蛋白不同区域对其细胞内定位的影响，证明PAT1第二个较大的胞质区对其溶酶体定位具有重要作用。 5.位于PAT1第二个胞质区的113FVDY116序列指导PAT1由内质网向高尔基体运输。该序列缺失后，PAT1滞留在内质网。并且过表达该突变体不能抑制mTORC1的活性。 6.将PAT1异位表达在线粒体上不能抑制mTORC1的活性，进一步说明PAT1需要定位在溶酶体上发挥抑制mTORC1的作用。 综上以上研究结果，本研究获得了两个主要发现。一是发现氨基酸可以诱导PAT1发生氨基端的蛋白剪切，导致PAT1失去一个溶酶体定位信号，38YQRF41，从而抑制PAT1向溶酶体的运输，促进激活mTORC1。二是发现PAT1在第二个胞质区具有重要的溶酶体定位信号。113FVDY116参与指导新合成的PAT1从内质网向高尔基体运输。如果将PAT1滞留在内质网上，或将PAT1异位表达在线粒体上，都不能抑制mTORC1的活性。以上结果对于阐明氨基酸转运蛋白调控mTORC1的机制具有重要的指导意义。

目录

声明

文献综述

第一章 氨基酸转运蛋白PAT1

1.1 PAT1的发现及其命名

1.2 PAT1运输的底物

1.3 PAT1的分布

1.4 PAT1蛋白的结构

第二章 mTORC1信号通路

2.1 mTOR信号通路概述

2.2溶酶体是激活mTORC1信号通路的重要场所

2.3影响mTORC1的上游信号

2.4 mTORC1的下游信号通路

2.5 mTORC1通路中氨基酸信号向溶酶体表面的传递

2.6 PAT1参与调控mTORC1

第三章 溶酶体定位信号

3.1经典的溶酶体跨膜蛋白运输机制

3.2非经典的溶酶体跨膜蛋白运输机制

试验研究

第四章 PAT1的氨基末端存在一个YxxΦ类型的溶酶体定位信号

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章 PAT1蛋白细胞内定位信号的研究

5.1材料

5.2方法

5.3结果

5.4讨论

5.5小结

第六章 PAT1异位表达对mTORC1信号通路的影响

6.1材料

6.2方法

6.3结果

6.4讨论

6.5小结

结论

创新点

下一步研究计划

参考文献

英文缩写词汇表

附录

致谢

作者简介