Luman在小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中的作用及机制研究

摘要

睾丸间质细胞分泌的睾酮在维持雄性第二性征和促进精子成熟中发挥着重要作用。睾酮的分泌过程需要多种类固醇激素合成酶的参与和调节。研究表明低浓度人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）能够提高睾丸间质细胞类固醇激素合成酶的表达，增加睾酮的分泌；高浓度hCG则会诱导睾丸间质细胞发生内质网应激，抑制类固醇激素合成酶的表达，减少睾酮的分泌。内质网应激相关蛋白Luman属于碱性亮氨酸拉链家族转录因子，在动物体内表达分布广泛且功能多样。研究表明Luman在小鼠子宫和卵巢中的表达呈生殖周期相关性，干扰卵巢颗粒细胞Luman蛋白表达能够下调类固醇激素合成酶的表达，减少雌激素和孕酮的分泌。在布雷菲德菌素（Brefeldin A，BFA）诱导细胞发生内质网应激时，Luman通过其特有的结构激活未折叠蛋白反应，促进错误折叠蛋白的运输和降解，缓解细胞的应激状态。然而，Luman在雄性小鼠生殖系统中的表达和在睾丸间质细胞睾酮分泌与hCG介导的睾丸间质细胞内质网应激中的作用与机制尚不清楚。 本试验运用Western-blotting、实时荧光定量PCR、免疫组织化学染色、组织和细胞免疫荧光、RNA干扰、睾丸显微注射、ELISA、细胞流式和双荧光素酶报告系统等方法，探究了（1）Luman在雄性小鼠生殖系统中的表达规律；（2）Luman在小鼠睾丸间质细胞中的表达定位及对睾酮分泌的影响；（3）Luman影响睾酮分泌的机制；（4）Luman在hCG诱导的MLTC-1细胞内质网应激过程中的作用。得到如下结果： 1.运用免疫组化、免疫荧光、RT-qPCR和Western-blotting技术检测，发现Luman在小鼠睾丸、附睾、输精管、储精囊、凝固腺、包皮腺等处表达广泛，在睾丸、附睾和输精管中相对表达量较高。在附睾中，Luman在附睾管壁和管腔内精子中均有表达。在精子中，Luman主要表达于成熟精子的尾部，表达量随精子成熟程度的增加而增加。在睾丸中，Luman特异性地表达定位于睾丸间质细胞中，表达量随小鼠日龄的增长而增加。 2.采用RT-qPCR、Western-blotting、免疫荧光和RNAi技术探究Luman在MLTC-1、原代睾丸间质细胞和睾丸中的功能。筛选出刺激睾丸间质细胞分泌睾酮的最适hCG浓度为1IU/mL。shLuman慢病毒感染MLTC-1细胞能够显著干扰细胞中Luman蛋白的表达，干扰率达80%。干扰Luman能够显著增加MLTC-1细胞睾酮的分泌量，上调类固醇激素合成酶StAR、Cyp11a1、3β-HSD和Cyp17a1的表达。通过睾丸显微注射的方法证明，注射进睾丸的shLuman慢病毒能显著干扰睾丸中Luman的表达，提高血清中睾酮的浓度。使用si-Luman能够有效地干扰原代睾丸间质细胞中Luman的表达，干扰效率达到75%。干扰Luman能够显著增加原代睾丸间质细胞睾酮的分泌量，上调类固醇激素合成酶StAR、Cyp11a1、3β-HSD和Cyp17a1的表达。 3.运用RT-qPCR、ELISA和双荧光素酶报告系统等对Luman调节睾丸间质细胞睾酮分泌的机制进行了探究。试验表明，干扰Luman能提高类固醇激素合成相关核受体Nur-77和SF-1启动子的活性，上调类固醇激素合成酶的表达，增加睾丸间质细胞睾酮分泌；干扰Luman可以提高LH/CG受体启动子活性，增加LH/CG受体的表达，提高细胞内cAMP的浓度，激活PKA通路，上调类固醇激素合成相关酶的表达，增加睾丸间质细胞睾酮分泌。 4.运用Western-blotting、RT-qPCR、ELISA和流式细胞术等技术，对Luman在MLTC-1细胞周期以及高浓度hCG诱导的内质网应激过程中的作用进行了探究。干扰Luman上调了细胞周期蛋白Cyclin A1、Cyclin B1和Cyclin D2表达，降低了S期MLTC-1细胞的比例。10IU/mL的hCG能够诱导MLTC-1细胞发生明显的内质网应激，并且内质网应激相关蛋白的表达量随hCG处理时间的增长而增加。在10IU/mL hCG处理下，干扰Luman能显著增加MLTC-1细胞睾酮分泌，上调Cyp11a1、p-IRE1、p-EIF2S1和BCL-2的表达，下调GRP78、CHOP和Caspase-3的表达。表明干扰Luman可以增加UPR相关蛋白和凋亡抑制因子的表达，减少促凋亡蛋白和因子的表达，促进MLTC-1细胞的存活与功能恢复，增加睾酮的分泌。 以上结果揭示了Luman在雄性小鼠生殖系统中的表达规律，探究了Luman影响睾酮合成的机制，充实了Luman在内质网应激过程中的作用。为进一步研究Luman在哺乳动物生殖过程中的作用提供试验依据，也为认识内质网应激与内分泌之间的关系提供了一个新的思路。

目录

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文献综述

第一章 Luman的结构和功能

1.1 Luman的发现

1.2 Luman的结构特点

1.3 Luman的生物学功能

1.4小结

第二章 睾酮生成及调控机制

2.1雄性小鼠生殖系统

2.2睾丸间质细胞的发育

2.3睾酮合成

2.4睾酮合成的调节

2.5小结

试验研究

3.1试验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

3.5小结

第四章 Luman对睾丸间质细胞睾酮分泌的影响

4.1试验材料

4.2实验方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

4.5 小结

第五章 Luman影响睾酮分泌的机制研究

5.1试验材料

5.2试验方法

5.3结果与分析

5.4讨论

5.5小结

第六章Luman在hCG介导的MLTC-1细胞内质网应激中的作用

6.1材料

6.2试验方法

6.3结果与分析

6.4讨论

6.5小结

第七章 结论

创新点

进一步研究

附录

参考文献

致谢

作者简介