苏云金杆菌NU-1、NU-2的混合发酵及毒力保护的研究

摘要

本文通过对苏云金杆菌NU-1、NU-2的3种配比(接种比例NU-1：NU-2分别为1：1，1：3，3：1)混合发酵结果得出：E配比(NU-1：NU-2接种比例为3：1)发酵同步率83％，在发酵终止(41h)菌数可达到68×108个/mL，晶体蛋白含量达到7.334mg/mL，比纯培养晶体蛋白含量分别增加了16.2％和16.8％。因此采用3：1为NU-1、NU-2混合发酵的最佳配比。 探讨了NU-2原生质体形成条件，得出最佳形成条件为：将菌体培养10h后再经活化5h，酶解缓冲液pH7.0，溶菌酶浓度1.5mg/mL，42℃处理60min。 采用紫外线和氯化锂为复合诱变剂，对NU-2原生质体进行诱变，筛选出发酵周期和NU-1菌株相同步的NU-2-16菌株，其晶体蛋白含量比出发菌株提高了10.03％ 诱变菌株NU-1、NU-2-16混合培养，发酵同步率达到98％，在发酵终止(40h)菌数可达到72.4×108个/mL，晶体蛋白含量达到7.896mg/mL，与出发菌株混合发酵相比晶体蛋白含量提高了7.7％。 对NU-1、NU-2-16混合发酵的混合氮源和C/N的研究得出：豆饼粉和酵母粉作为混合氮源时，发酵周期提前到38h；C/N为1：2.5时，发酵液中的菌数和晶体蛋白含量较高。并通过L16(45)正交试验，确定了混合发酵的优化培养基为(％)：豆饼粉2.5，酵母粉2.5，淀粉2.0，CaCO30.15，K2HPO40.5，MgSO40.035。在此条件下，发酵终止(38h)菌数达到了83.6×108个/mL，晶体蛋白含量达到8.351mg/mL。 研究了不同浓度腐殖酸，刚果红，甲基绿及蚕蛹干粉作为紫外防护剂对芽孢的保护作用，得出0.05％刚果红防护效果最好，其次是0.1％甲基绿、0.5％蚕蛹干粉和0.5％腐殖酸。SDS-PAGE电泳图谱得出：添加0.05％刚果红的伴孢晶体经裂解后产生的135和65道尔顿两种毒素蛋白区带，在紫外线照射4h还存在，说明刚果红对苏云金杆菌的伴孢晶体有明显的保护作用。

目录

文摘

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第一部分前言

1苏云金杆菌的概述

1.1苏云金杆菌的发现及命名

1.2苏云金杆菌的致病机理

1.3转基因抗虫植物

2混合发酵的研究

2.1影响混合发酵的因素

2.2苏云金杆菌混合发酵的研究

2.3混合发酵的前景展望

3原生质体技术的简介

3.1原生质体的概念

3.2原生质体生物学特性

3.3原生质体制备的原理

3.4影响原生质体制备的因素

3.5苏云金杆菌原生质体诱变研究

4培养基的筛选

4.1 Bt发酵生理学

4.2营养条件对Bt产孢期和毒素蛋白的形成的影响

4.3筛选培养基的条件及方法

4.4农副产品的利用

5紫外防护剂的研究现状

6 Bt的研究展望

第二部分材料和方法

1材料

1.1菌种

1.2所用主要培养基

1.3所用主要试剂

1.4仪器和设备

2实验方法

2.1 NU-1、NU-2菌种形态和生长特性

2.2 NU-1、NU-2不同配比的混合发酵

2.3 NU-2原生质体的制备及诱变筛选

2.4将诱变后的新菌株NU-2-16与NU-1混合发酵及培养基筛选

2.5紫外防护剂的应用

第三部分结果与讨论

1菌体形态和生长特性

2 NU-1、NU-2不同配比的混合发酵

2.1两种菌相互关系培养测试结果

2.2 NU-1、NU-2混合发酵不同配比生长曲线的变化

2.3 NU-1、NU-2混合发酵不同配比pH值的变化

2.4 NU-1、NU-2混合发酵不同配比晶体蛋白含量的测定

3 NU-1原生质体的诱变及筛选

3.1 NU-2菌株原生质体的形成及细胞壁对溶菌酶的敏感性

3.2菌龄对NU-2原生质体形成的影响

3.3酶解液pH值对原生质体形成的影响

3.4溶菌酶处理时间对原生质体形成和再生的影响

3.5溶菌酶处理温度对原生质体形成和再生的影响

3.6溶菌酶浓度对原生质体形成和再生的影响

3.7原生质体的复合诱变

4苏云金杆菌NU-1与NU-2-16的混合发酵及营养条件的筛选

4.1苏云金杆菌NU-1与NU-2-16的混合发酵

4.2混和氮源的筛选结果

4.3最佳碳氮比(C/N)的筛选

4.4种子瓶培养基的筛选

4.5五因素四水平正交实验筛选发酵培养基结果

5紫外防护剂对苏云金杆菌的保护作用

5.1腐殖酸，刚果红，甲基绿及蚕蛹干粉的光学性质

5.2紫外防护剂对芽孢的防护作用

5.3紫外防护剂对伴孢晶体的保护作用

结论

参考文献

附录

致谢