基因重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白及其分离纯化

摘要

本文主要研究了基因重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白及其分离纯化的过程。考察了三种不同的控氧方式，即葡萄糖反馈、提高罐压、富氧通气；四种不同间歇周期的补氮操作，即每隔25s补加补料氮溶液1.5mL(1.5mL/25s)、18mL/5min、36mL/10min、72mL/20min；诱导条件，即诱导时机、发酵液中乙酸浓度、诱导强度；对细胞生长和目标蛋白(类人胶原蛋白)表达的影响。对细胞生长和类人胶原蛋白表达的动力学、代谢途径通量进行了分析。研究了批量离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法对类人胶原蛋白进行纯化的控制工艺。结果表明： 1.采用提高罐压的控氧方式控制发酵液中溶解氧在培养过程中维持于20％～30％饱和度，可以使最终的细胞产量达到77.3g·L-1，类人胶原蛋白的表达量为13.9g·L-1，均高于葡萄糖反馈和富氧通气两种控氧方式下的细胞产量和类人胶原蛋白表达量； 2.当补料氮溶液的添加方式为36mL/10min时，最终细胞产量可达到84g·L-1，类人胶原蛋白的表达量为14g·L-1，分别为四种补氮周期操作方式下的最大者； 3.当细胞处于对数生长的中后期时，升温至42℃进行诱导，可使最终的类人胶原蛋白表达量达到10.3g·L-1，要高于当细胞处于对数生长的中期和后期时进行诱导时类人胶原蛋白的表达量； 4.发酵液中代谢副产物乙酸的存在对细胞生长和类人胶原蛋白的表达均可产生非常显著的影响。当发酵液中乙酸钠的添加量为3.0g·L-1时，最终细胞产量和类人胶原蛋白的产量仅为43.3g·L-1和2.0g·L-1，类人胶原蛋白产量仅为不添加乙酸钠时的20％； 5.诱导强度对最终类人胶原蛋白的产量可产生显著的影响。42℃保持时间太短，细胞诱导不够充分；42℃保持时间太长，细胞活性部分丧失，对产物表达产生不利影响。当采用42℃诱导3h后降温至39℃继续诱导5h的策略时，最终的细胞产量和类人胶原蛋白产量分别为78.5g·L-1和v12.8g·L-1，均为四种诱导方式中最高； 6.根据培养过程中不同时间段的不同特性，将整个发酵过程划分为三个阶段，即批式培养阶段、诱导前补料培养阶段以及诱导阶段。运用数学工具MATLAB对发酵过程采集的数据进行处理，可得到三个阶段的细胞生长、底物消耗和类人胶原蛋白表达的动力学模型：(1)批式培养阶段dX/dt=0.6978×S*X/0.0149+SdS/dt=-0.6978×S*X/0.4297×(0.0149+S)-0.0084X (2)诱导前补料培养阶段dX/dt=1.3836(X-X2/106.8928)/0.0792X+2-X/498[2.8122(X-X2/106.8928)/0.0792X+2+0.0073X] (3)诱导阶段dX/dt=1.3956X/0.0627X+2(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)-X/498×[3.2478X/(0.0627X+2)(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)+0.0911X+0.3591/0.0.0627X+S(1-X/76.9637)+0.055/46.3527(1-P/24.5785)X]dV/dt=V/498×[3.2478X/(0.0627X+2)(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)+0.0911X+0.3591/0.0627X+S(1-X/)76.9637)+0.055/46.3527(1-P/24.5785)X]dP/dt=(0.3956X/0.0627X+S(1-X/76.9637)+0.055)(1-P/24.5785)X-P/498×[3.2478X/(0.0627X+2)(1-X/76.9637)(1-P/21.6735)+0.0911X+0.3591/0.0627X+S(1-X/)76.9637)+0.055/46.3527(1-P/24.5785)X] 7.对代谢途径中间代谢反应采用拟稳态处理，进行代谢通量分析(MFA)，结果表明： (1)诱导以前的补料培养阶段，三种不同控氧方式下细胞的代谢通量存在一定差异，其中葡萄糖反馈方式下，进入PP途径的代谢通量分率最高，从代谢的角度证明了葡萄糖反馈的控氧方式下细胞的得率最高。 (2)诱导以前的补料培养阶段，四种不同补氮方式下细胞的代谢通量也存在一定差异，当补料氮溶液的添加方式为36mL/10min时，进入PP途径的代谢通量分率最高，而进入EMP途径和TCA循环的代谢通量分率最小； (3)诱导以后，三种不同控氧方式下细胞进入PP途径的代谢通量均比诱导前显著下降。其中富氧通气的控氧方式下，PP途径的代谢通量下降幅度最大，也达到了三种控氧方式中的最低。而提高罐压的操作方式下进入TCA循环的代谢通量最高，以提供产物合成所需的前体需求； (4)诱导以后，四种不同补氮方式下细胞进入PP途径的代谢通量也均比诱导前显著下降。其中，当补料氮溶液的添加方式为36mL/10min时，诱导以后进入PP途径的代谢通量仍旧最高。 8.选取阴离子交换树脂DEAE52来吸附杂蛋白，缓冲体系采用Tris-盐酸，pH值为7.0，NaCl浓度为0.2mol·l-1，蛋白进料浓度为40mg·mL-1；并选用SephadexG-100进一步进行凝胶过滤层析。最终类人胶原蛋白的纯度可达到98.2％，纯化倍数为3.1，回收率为80.6％。

目录

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摘要

第一章综述

第二章试验材料与方法

第三章控氧方式对细胞生长和类人胶原蛋白表达的影响

第四章周期操作对细胞生长和类人胶原蛋白表达的影响

第五章诱导条件的优化

第六章高密度发酵的动力学研究

第七章高密度发酵表达类人胶原蛋白的代谢通量分析

第八章类人胶原蛋白的分离纯化

攻读博士学位期间取得的科研成果

致谢