蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

摘要

蜘蛛大壶腹腺产生的牵引丝具有优良的机械特性，是自然界综合性能最好的天然生物材料之一，具有高强度、高弹性和高断裂功的特点，其强度为钢丝的5倍，韧度为Kelvar纤维的3倍;在低温和高温等极端条件下，天然蜘蛛丝仍然具有优异的性能。基于这些独特的物理和生物学特性，蜘蛛牵引丝在医学、材料、军事等方面具有广泛的应用前景。然而，蜘蛛的天性决定了无法通过大规模饲养的途径获取大量蜘蛛丝蛋白，因此利用基因工程的方法异源表达重组蜘蛛丝蛋白就成为规模化获取蜘蛛丝蛋白的有效途径。
　　通过应用现代生物技术和高分子化学手段研究天然蜘蛛丝的组成、结构、性能及其形成原理，研究人员提出了一种新的基于天然蜘蛛丝蛋白结构的基因工程方法，依据蜘蛛丝蛋白高度保守的结构域以及具有大量串联重复的一致序列的特点，通过分子克隆的手段获取接近天然长度的编码基因，利用多种表达系统获得与天然蜘蛛丝蛋白极其相似的蛋白质，并模拟天然蜘蛛丝成丝过程，在体外成功制备出人工蜘蛛丝纤维，这为具有成本效益地大规模人工生产蜘蛛丝提供了理论和技术基础。
　　在基因工程蜘蛛丝蛋白核心序列研究方面，目前已经研究清楚蜘蛛丝蛋白有几大类重复基序，基本上可以归纳为丙氨酸富含基序(An/(GA)n）、GPGXX五肽基序、GGX基序和间隔区(Spacer)基序四类，这四类基序形成有一定特征的结构来履行独特的功能。其中丙氨酸富含基序形成β-折叠片层，为蜘蛛丝提供强度;GPGXX五肽基序形成β-转角螺旋，为蜘蛛丝提供高的弹性。基于天然蜘蛛丝优良特性的结构基础是由4个简单重复的氨基酸基序组成的非常保守的蛋白序列，可以采取将关键功能单元进行重复性拼接来获得基因工程蜘蛛丝蛋白编码基因序列。目前，国际上普遍采用将这些高度保守的功能单元组合拼接，实现基因工程蜘蛛丝全长序列的构建，并且获得了性能接近天然蜘蛛丝的人工合成蜘蛛丝。因此，通过基因重组的方式，对核心单元串联拼接的构建方式是通过研究证实的、行之有效的基因工程蜘蛛丝编码基因克隆的通用策略。
　　结合基因工程蜘蛛丝合成当前的国内外研究进展以及存在的一些问题，本论文主要从以下三个方面开展相关研究工作:
　　第一部分:基因工程蜘蛛丝蛋白分子设计
　　本部分研究首先检索国际上已有报道的基因工程蜘蛛丝蛋白的核心结构单元，从中选取具有代表性的基因工程蜘蛛丝核心序列与天然的蜘蛛牵引丝蛋白核心序列通过计算机辅助分子模拟技术，模拟其可能的空间构象，进而挑选出一条在空间结构上最接近于天然蜘蛛丝蛋白的序列;随后根据大肠杆菌的三联体密码子偏好性，选取蜘蛛丝核心序列所对应的大肠杆菌偏性密码子，从而设计出适用于大肠杆菌系统表达的基因工程蜘蛛丝核心基因编码序列;最后根据核心序列串联拼接及原核表达载体构建中所需要的限制性内切酶位点，在核心序列的两端分别加上克隆酶切位点，并于序列两端加上保护碱基。
　　通过分析与设计，设计获得了长度为135bp的基因工程蜘蛛丝核心基因序列，以该序列作为单体，通过后续的连续串联拼接，可以获得接近天然蜘蛛丝基因序列长度的目的基因，从而为后续开展基因工程蜘蛛丝编码基因克隆以及表达载体构建研究提供可靠的序列信息。
　　第二部分:基因工程蜘蛛丝核心序列的拼接及载体构建
　　获取基因工程蜘蛛丝重组载体是本项目开展的重要基础性工作，通过分子生物学技术构建接近天然蜘蛛丝大小的串联拼接基因片段是最终决定基因工程蜘蛛丝性能的关键。
　　本部分研究我们采用同尾酶连接法进行基因工程蜘蛛丝基因序列的串联拼接，以全基因合成的核心序列单倍串联体——pBSK1序列为基础，分别进行XmaⅠ/ScaⅠ和BspEⅠ/ScaⅠ双酶切，回收酶切目的片段，T4连接酶快速连接，转化至DH5α感受态细胞，重组子经过Amp抗性筛选和重组克隆载体的酶切鉴定，得到2倍串联体克隆重组子，在此基础上重复上述过程，使得棱心序列依次倍加，最终获得96串联体克隆重组子;对所有的克隆重组子进行酶切鉴定，确认插入的目的基因片段大小无误。最后，将构建的克隆载体酶切，连接至已经线性化的pET28a(+)质粒，构建出含有蜘蛛丝核心序列的串联体原核表达载体。
　　本部分研究利用基因工程技术和分子生物学手段，获得了基因工程蜘蛛丝2-96倍串联体克隆载体，并构建出含有蜘蛛丝核心序列的串联体原核表达载体。经限制性内切酶反应鉴定插入序列完全正确，上述克隆载体和表达载体的获得为下一步基因工程蜘蛛丝的原核表达奠定了基础。
　　第三部分:基因工程蜘蛛丝蛋白的表达与鉴定
　　如何将构建的蜘蛛丝蛋白表达载体导入到原核或真核细胞中实现高效表达;并通过优化纯化方法获取大量高纯度的蜘蛛丝蛋白是进行蜘蛛丝纺丝的重要前提。
　　本部分研究旨在鉴定所构建的基因工程蜘蛛丝不同串联体的表达载体能够在大肠杆菌中正确表达目的片段，我们将原核表达载体转化至BL21(DE3)感受态中，获取转化阳性克隆菌株后，在37℃培养至OD600约0.6后，加IPTG至终浓度为1mmol/L，于30℃诱导表达6h后，收获培养细胞，制备全菌裂解液上清，以10％的 SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹实验对目的蛋白的表达情况进行鉴定。
　　结果表明:空载体对照pET28a(+)没有检出相关蛋白的表达，而不同串联体基因工程蜘蛛丝蛋白表达载体均检测到有目的重组蛋白的表达，且产物大小分别与预期相对分子质量一致。除上述特异性目的蛋白之外，均未发现有其他截断的阳性蛋白条带存在，同时也说明在基因工程蜘蛛丝蛋白原核表达过程中，未发生提前翻译终止的现象和基因删节表达现象。本部分研究验证了所构建的基因工程蜘蛛丝表达载体的正确性，并初步获得重组目的蛋白的表达，为下一步开展基因工程蜘蛛丝蛋白的高密度发酵工作奠定基础。
　　综上所述，本研究以研制高强度的基因工程蜘蛛丝为目标，围绕基因工程蜘蛛牵引丝蛋白Masp1原核表达载体构建及蛋白表达的关键技术环节，通过计算机辅助的分子设计方法，筛选了空间结构与天然蜘蛛丝最为相近的核心序列;利用同尾酶连接方法，将单倍体依次串联拼接，成功构建了2-96串联体基因工程蜘蛛牵引丝蛋白Masp1原核表达载体，在此基础上，实现了上述表达载体在大肠杆菌中的表达，验证了所构建载体的正确、充分地表达，并无表达提前终止的现象。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一部分：基因工程蜘蛛丝蛋白分子设计研究

1．材料

2．方法

2．1．天然蜘蛛丝蛋白核心区空间结构的模拟

2．2．基因工程蜘蛛丝蛋白核心隰空间结构的模拟

2．3．基因工程蜘蛛牵引丝蛋白编码序列的设计

3．结果

3．1．天然蜘蛛丝蛋白核心区空间结构的模拟

3．2．基因工程蜘蛛丝蛋白核心区空间结构的模拟

3．3．基因工程蜘蛛牵引丝蛋白编码序列的设计

4．讨论

第二部分：基因工程蜘蛛丝核心序列的拼接及载体构建研究

1．材料

1．1．菌株和质粒

1．2 工具酶及主要试剂

1．3．培养基

1．4．仪器和设备

2．方法

2．1．基因工程蜘蛛丝核心单元2-96串联体克隆载体的构建

2．2．基因工程蜘蛛丝核心单元32，48，64，96串联体原核表达载体的构建

3．结果

3．1．基因工程蜘蛛丝基因序列2倍体的构建

3．2．基因工程蜘蛛丝基因多倍串联体的构建

4．讨论

第三部分：基因工程蜘蛛丝蛋白的表达与鉴定

1．材料

1．1．菌株和质粒

1．2．主要试剂

1．3．培养基

1．4．仪器和设备

2．方法

2．1．溶液的配制

2．2．基因工程蜘蛛丝蛋白的表达与鉴定

3．结果

3．1．基因工程蜘蛛丝蛋白原核表达的SDS-PAGE鉴定

3．2．基因工程蜘蛛丝蛋白原核表达的蛋白免疫印迹分析鉴定

4．讨论

讨论

结论

参考文献

文献综述 蜘蛛牵引丝的蛋白序列、结构及其生物纺丝过程

代表性论著

个人简历

致谢