蛋白质组学中的多维液相色谱—质谱技术研究及其在胰腺癌标志物筛选中的应用

摘要

蛋白质组学是生命科学中继基因组计划之后最为活跃的热点研究领域，蛋白质组学研究的关键在于蛋白质的分离和鉴定。二维凝胶电泳是目前应用最为广泛的蛋白质组学分离技术，但其存在着诸多难以克服的缺陷；多维液相色谱以其分离效率高、方法灵活多样，且容易实现自动化的特点，受到越来越多的研究者的重视，在蛋白质组学研究中逐渐扩大了应用范围。本研究利用离线多维液相色谱联用，对人血清和组织蛋白质进行了分离并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MADLI-TOFMS)进行检测鉴定；将其应用于胰腺癌肿瘤标志物的筛选研究中，取得了比较满意的效果。 本论文主要包括以下五个部分： 1.前言部分。简述了蛋白质组学及其研究中的分离、生物质谱鉴定技术、生物信息学以及差异蛋白质组学研究等内容；介绍了胰腺癌的研究进展以及本研究的主要内容和意义。 2.体积排阻—反相色谱—质谱(SEC-RPLC-MS)对血清蛋白质组的研究。首先将血清样品使用缓冲溶液稀释、脲溶液变性和疏水色谱饼预分离三种方式进行预处理，并对预处理的条件作了优化和比较。预处理后的样品通过体积排阻(sizeexclusionchromatography,SEC)和反相色谱(reversephasechromatography,RPLC)离线联用分离后，使用MADLI-TOFMS对各个组分进行检测。结果表明选择浓度为5.0mol·L-1的脲溶液进行变性，有效降低了血清中高丰度蛋白对低丰度蛋白的影响。采用疏水色谱饼对血清进行预分离，提高了样品处理量，有利于低丰度蛋白的富集和分离。同时研究中以肌红蛋白为模型使用质谱对其结构进行了鉴定，方法稳定，结果准确。 3.亲合色谱—反相色谱—质谱(AFC-RPLC-MS)对血清糖蛋白质组学的研究。建立了使用AFC-RPLC分离和质谱检测研究人血清中糖蛋白质组学的技术平台。通过两种不同方法对硅胶进行化学改性后，键合伴刀豆球蛋白(concanavalinA，ConA)，制备了亲合色谱柱。使用该亲合色谱(affinitychoromatography，AFC)柱对标准糖蛋白RNaseB进行了分离纯化，并对分离条件作了优化。用糖肽酶PNGaseF和胰蛋白酶对RNaseB进行酶切后，再使用ConA亲合柱分离出糖肽和多糖，结合使用质谱源后衰变技术，对糖蛋白的糖含量、糖蛋白的氨基酸序列、糖基化位点及糖连接方式作了研究。利用亲合色谱对血清中的糖蛋白和酶解后的糖肽进行了分离，结果表明该方法可用于血清中N-连接甘露糖型糖蛋白研究，并可以推广用于糖蛋白质组的研究。 4.胰腺组织的多维液相色谱质谱研究。使用离子交换色谱(ionexchangechromatography,IEC)对样品进行预分离，再用SEC-RPLC分离并用MALDI-TOFMS检测，共检出300余种不同质荷比的蛋白/多肽分子。该方法灵活简便，可作为组织样品蛋白质组研究的通用型方法。 5.胰腺癌标志物的筛选研究。在前述方法基础上，通过对健康人血清和胰腺癌术前、术后患者血清进行多维色谱分离和MALDI-TOFMS检测，并以胰旁系癌患者血清检测结果作为对照，筛选出两种显著差异蛋白分子。其中分子量为5734D的蛋白质/多肽在胰腺癌患者血清中呈现明显上调，阳性检出率为76.19％，特异性达到80.77％。，分子量为5923D的蛋白质/多肽在胰腺癌患者血清中呈现下调，敏感性达为73.33％。对胰腺癌患者及健康人血清中糖蛋白进行了差异筛选，同样找出了分子量为5734D差异分子，初步确定其为糖蛋白/糖肽分子，并可以作为胰腺癌诊断的标志物。对比分析正常和癌变胰腺组织中蛋白质谱数据后，筛选出16种差异蛋白分子，其中有11种在癌变胰腺组织中高表达，5种在癌变组织中低表达。这些标志物分子有望成为胰腺癌诊断的新的肿瘤标志物。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章 SEC-RPLC-MS对人血清蛋白质组的研究

第三章AFC-RPLC-MS对人血清糖蛋白质组的研究

第四章 胰腺组织的多维液相色谱——质谱研究

第五章胰腺癌标志物的筛选研究

参考文献

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