重组血管生长抑制因子Kringle 5的分离纯化

摘要

血管生长抑制因子 kringle 5 是目前发现的抑制血管增生活性最强的溶酶原片段，可有效抑制内皮细胞的增殖和迁移。它具有高效、高细胞选择性以及短的氨基酸序列的特点，这使它具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值。 本研究在构建融合型血管生长抑制因子kringle 5原核表达系统及工程菌发酵条件优化的研究基础上，开始rK5蛋白分离纯化工艺的探索研究。先后采用了中性盐沉淀法(包括氯化钠和硫酸铵的分级沉淀)、等电点沉淀法、柱色谱法等多种不同的分离纯化工艺，反复试验、逐步筛选，最后建立了两步柱色谱法分离纯化重组kringle 5的新工艺。 两步柱色谱法分离纯化重组血管生长抑制因子kringle 5的工艺主要包括：Ni<'2+>螯合的 Chelating Sepharose Fast Flow 亲合柱色谱和Sephadex G-75凝胶排阻柱色谱。其中Ni<'2+>螯合的 Chelating Sepharose Fast Flow亲和色谱柱规格为20×1.0 cm i．d．，流动相 A 为20 mmol/L PBS+0.5 mol/L NaCl (pH 7.4)溶液，流动相B为20 mmol/L PBS+0.5 mol/L NaCl+0.5 mol/L 咪唑 (pH 7.4)溶液，采用等度+梯度的方式洗脱，洗脱流速为2.0 mL/min。Sepharose G-75凝胶排阻色谱柱规格为100×1.5 cm i．d．，流动相为10 mmol/L PBS+0.15 mol/L NaCl (pH 7.4)溶液，采用等度方式洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min。研究发现采用此工艺后，经第一步亲和柱色谱分离得到的目的蛋白用变性聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析，其纯度约为80％，蛋白得率约为1.92％；再经第二步凝胶柱色谱分离后得到目的蛋白纯度约为96％，蛋白总得率约为0.63％。最后，采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法对得到的纯化产物进行生物活性分析，结果表明纯化产物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生长抑制作用明显。 研究结果表明，两步柱层析法分离纯化重组血管生长抑制因子kringle 5的工艺路线正确，技术可行，为重组kringle 5的大规模生产和临床应用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

Ⅰ文献综述

Ⅱ实验部分

1实验材料

1.1菌种及质粒

1.2试剂

1.3培养基

1.4仪器设备

2工程菌的发酵

3纯化工艺研究

3.1发酵液的处理

3.2重组Kringle 5的纯化

4分析与检测

4.1菌体浓度的测定

4.2变性聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳

4.3蛋白质的含量分析

4.4重组Kringle 5生物活性的测定

Ⅲ结果与讨论

1工程菌发酵结果与讨论

2纯化工艺结果与讨论

2.1中性盐沉淀法纯化工艺结果与讨论

2.2等电点沉淀法纯化工艺结果与讨论

2.3柱色谱纯化工艺结果与讨论

3分析与检测实验结果与讨论

3.1 SDS-PAGE电泳分析

3.2重组Kriingle 5的含量分析

3.3活性鉴定

Ⅳ结论

1结论

2存在的主要问题

参考文献

致谢