重组大肠杆菌生产肿瘤血管生长抑制因子kringle5发酵条件的优化及纯化

摘要

本研究论文通过对重组大肠杆菌生产肿瘤血管生长抑制因子kringle5发酵工艺和纯化工艺的优化，进一步提高kringle5蛋白的表达量，寻找一种简单、快速、分离效果好的纯化工艺。首先，在构建融合型肿瘤血管生长抑制因子kringle5原核表达系统的基础上，通过改变培养基中氮源的种类和含量、无机盐的种类和含量以及碳氮比，确定了最合适的培养基为(g/L)：酵母提取物10，NH4Cl1.33，NaH2PO42，Na2HPO45，MgSO4·7H2O1，葡萄糖6。采用优化后的培养基，通过正交实验，对重组菌的发酵工艺进行了优化，优化后的重组菌发酵条件为：温度35℃，pH7.0，接种量8％，摇床转速260r/min，诱导剂浓度0.8mmol/L，诱导时机OD6000.6，诱导时间6h。摇瓶发酵的七个因素中，溶液中诱导剂的浓度是最显著的影响因素，诱导时间、诱导时机、温度、pH、摇床转速的影响次之，而接种量的影响不显著。通过发酵罐中重组菌的分批培养，确定了培养液中的最佳溶氧量为40％。采用优化后的发酵工艺，在20L发酵罐中kringle5蛋白的表达量可达0.59g/L。采用Cu2+螯合的SepharoseFastFlow柱和CMSepharoseCL-6B阳离子柱两步层析对蛋白进行了纯化，kringle5蛋白的最终纯度为96％，得率为0.3％。通过鸡胚绒毛尿囊膜法证明kringle5蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管增生有一定的抑制作用。

目录

文摘

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Ⅰ文献综述

1肿瘤的生长、转移与血管生成的关系

1.1肿瘤的生长过程

1.2肿瘤的转移机制

1.3肿瘤的生长、转移与血管生成的关系

2肿瘤血管生长抑制因子与肿瘤的抗血管生成疗法

2.1肿瘤血管生长抑制因子

2.2肿瘤的抗血管生成疗法

3肿瘤血管生长抑制因子kringle5

3.1肿瘤血管生长抑制因子kringle5的结构

3.2 Kringle5抑制血管增生的分子机制

3.3 Kringle5对血管增生性疾病治疗的实验研究

3.4 Kringle5的基因工程药物开发及应用

4本研究的意义

5研究开发的方向和重点

Ⅱ实验部分

1试剂与仪器

1.1试剂

1.2菌株及质粒

1.3培养基

1.4仪器

2工艺研究

2.1发酵工艺的优化

2.2 K5蛋白的纯化

3分析与检测

3.1菌体浓度的测定

3.2葡萄糖浓度测定

3.3 SDS-PAGE凝胶电泳

3.4蛋白浓度分析

3.5 K5生物活性测定

Ⅲ结果与讨论

1工艺研究结果与讨论

1.1发酵工艺的优化

1.2 K5蛋白的纯化

2分析与检测

2.1葡萄糖浓度测定

2.2 SDS-PAGE凝胶电泳

2.3纯化K5溶液蛋白浓度测定

2.4 K5活性测定

Ⅳ结论

1结论

2存在的主要问题

参考文献

致谢