红景天中苷(苷元)类成分的抗辐射活性及其在Caco-2模型中的转运机制研究

摘要

随着我国“神州”载人航天飞行的圆满成功,目前载人航天已成为我国一项重大的系统工程,被列入国家的经济建设计划中。在长期航天飞行中,空间辐射是危害宇航员健康的主要因素之一。提高航天员对空间特殊环境的适应能力和耐受能力,有效保障航天员健康是确保航天任务圆满完成的重要前提。
　　景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)植物为多年生草本或亚灌木植物,已有研究证明其具有明显的抗辐射、抗氧化和调节免疫等作用。但目前对红景天的研究仅限于对其粗提物或红景天苷的研究,对于其它活性成分的作用以及可能的机制则尚无系统的研究报道。苯乙素糖苷-红景天苷(苷元为酪醇)和苯丙素糖苷-洛塞琳、络萨维(苷元为肉桂醇)是红景天属植物的两类主要活性成分,具有独特的药理功能,因而成为近年来红景天活性研究的热点。
　　本研究针对红景天中苷(苷元)类成分,从辐射防护的抗氧化机制和免疫保护作用两个角度切入,通过建立体外抗氧化模型和辐射所致的淋巴细胞损伤模型,对红景天中苷(苷元)类成分进行辐射防护活性评价,筛选得到抗辐射活性成分。基于筛选评价的结果,通过Caco-2单层细胞体外渗透转运模型对目标抗辐射活性成分的口服吸收情况进行预测,对其转运机制及影响因素进行初步探讨,评估其作为辐射防护剂的可行性,为进一步深入了解其在体内的口服吸收情况以及生物利用度等问题提供实验依据,为下一步开发高效、低毒的辐射防护剂提供基础研究资料,为潜在辐射防护剂的研发和利用奠定实验基础。
　　本研究主要围绕以下三方面内容展开:
　　(一)从辐射防护的抗氧化机理出发,利用自由基清除原理建立并优化六种体外抗氧化模型,系统地对红景天中苷(苷元)类成分的抗氧化活性进行评价。
　　辐射生物学效应产生的最根本原因,是由于射线作用于机体导致的生物分子电离和激发的直接作用,以及由此产生超氧阴离子,羟自由基等活性氧(Reactive oxygen species,ROS)导致的继发作用,如核酸分子、蛋白质分子以及生物膜的损伤等。因此,清除已经形成的ROS或者抑制其产生,是辐射防护的主要途径之一。本研究建立并优化了DPPH自由基、NBT-NADH-PMS体系、羟自由基、氮氧自由基(NO)、脂质过氧化反应体系和铁离子抗氧化体系六种抗氧化模型,分别测定了芦丁苷、红景天苷、异槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷、络萨维和肉桂醇对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基和NO自由基四种自由基的清除能力,以及对脂质过氧化的抑制能力和总抗氧化能力。结果表明,红景天中的苷(苷元)类化学成分从不同方面表现出抗氧化活性:红景天苷、酪醇、洛塞琳、络萨维和肉桂醇表现出较强的羟自由基清除能力(IC50分别为18.97μg·mL-1,10.84μg·mL-1,61.84μg·mL-1,81.08μg·mL-1,26.00μg·mL-1)。芦丁苷和异槲皮苷表现出较强的DPPH自由基和超氧阴离子清除能力,抗脂质过氧化和总抗氧化能力;熊果苷的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力较强。
　　(二)从辐射防护剂的免疫保护作用出发,利用细胞学和分子生物学实验方法建立体外辐射防护模型,在细胞水平上对红景天中苷(苷元)类化合物的体外抗辐射活性进行评价。
　　免疫系统是辐射损伤的重要靶器官,具有高度的辐射敏感性。淋巴细胞损伤是辐射导致机体免疫功能抑制的重要原因,因此有效地保护淋巴细胞免受辐射损伤对降低机体辐射损伤有重要意义。本研究先通过细胞增殖检测方法比较,细胞辐射敏感性研究,增殖与辐照的量效关系考察等方面,对建立体外辐射防护模型进行了方法学评价;又在确保受试物对细胞无毒的基础上,通过给予人淋巴母细胞(AHH-1)10Gy60Co-γ射线一次性照射建立辐射损伤模型,以MTS法检测红景天苷、芦丁苷、异槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷和络萨维对受到辐射后AHH-1细胞的保护作用。研究结果显示,与模型组比较,异槲皮苷(12.5μg.mL-1,P<0.05)、红景天苷(12.5μg.mL-1,P<0.05)、酪醇(50μg.mL-1,P<0.05)、洛塞琳(25μg.mL-1,P<0.05)、络萨维(12.5μg.mL-1,P<0.01)和熊果苷(12.5μg.mL-1,P<0.01)均能够显著提高辐射损伤AHH-1的增殖活性。基于抗氧化与免疫保护两部分实验结果,确定了红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维为目标抗辐射活性成分,进行下一步的渗透转运研究。
　　(三)建立用于药物吸收研究Caco-2渗透转运模型,评价目标抗辐射活性成分的口服吸收情况,初步探讨其转运机制。
　　通过观察细胞单层形态,监测跨膜电阻(TEER)值的变化以及比较普萘洛尔和阿替洛尔两种标记物在单层模型的转运特性等指标对Caco-2细胞单层模型的可靠性进行评价。结果显示,TEER值在Caco-2细胞单层形成过程中稳定上升,达到实验模型要求标准(>500Ω·cm2)。胞内转运标记物普萘洛尔(高渗透性药物,表观渗透系数(Papp)=1.01×10-5cm·s-1)和胞间转运标记物阿替洛尔(低渗透性药物,Papp=2.20×10-7cm·s-1)呈现可预见的高、低Papp值,表明建立的Caco-2细胞模型在完整性、通透性等方面均符合小肠吸收机制研究的要求。结合抗氧化与体外AHH-1模型两部分实验结果,选定抗氧化作用和保护60Co-γ射线辐照后AHH-1细胞两方面作用均较强的红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维为目标抗辐射活性成分,通过体外Caco-2渗透转运模型对这四个成分的肠毒性、吸收情况及转运机制进行研究。本研究通过考察抗辐射活性成分对Caco-2细胞24h的细胞毒性作用,对目标成分的肠毒性进行评估,并推算其用于转运模型的安全剂量;在建立了可靠的转运模型和确保受试物对Caco-2细胞单层无显著毒性的前提下,应用Caco-2单层模型对受试物进行了双向转运研究(肠腔侧向肠壁侧,AP→BL;肠壁侧向肠腔侧,BL→AP),考察了转运时间(60min-180min)和药物浓度(50μM-200μM)对转运的影响。然后,采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定并计算受试物在渗透转运模型中的Papp。AP→BL转运数据表明,红景天苷(Papp=0.85±0.12×10-6cm·s-1)、洛塞琳(Papp=0.61±0.10×10-6cm·s-1)和络萨维(Papp=0.74±0.12×10-6cm·s-1)均为难吸收(PappAP→BL<1×10-6cm·s-1)药物。红景天苷的苷元酪醇(Papp=1.52±0.16×10-6cm·s-1)渗透性要好于红景天苷。浓度为200μM时辐射防护活性成分的双向转运数据未表现出明显方向性(0.61×10-6cm·s-1　　综上所述,红景天中的苷(苷元)类化学成分从不同方面均表现出一定的抗氧化活性。其中,红景天苷、酪醇、洛塞琳、络萨维和肉桂醇表现出较强的羟自由基清除能力。在淋巴细胞损伤模型中,异槲皮苷、红景天苷、络萨维、洛塞琳、熊果苷和酪醇均能够显著提高辐射损伤的AHH-1细胞的活力。两部分筛选结果提示红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维可能为红景天中的抗辐射活性成分。在Caco-2单层模型中的转运研究中发现,红景天苷、洛塞琳和络萨维均为难吸收药物;而作为红景天苷的苷元-酪醇,其吸收性优于红景天苷。

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前言

1 红景天属植物简介

2 红景天在与课题相关领域的国内外研究现状

3 立题依据及本研究的意义

参考文献

第一部分 红景天中八种苷（苷元）体外抗氧化作用的研究

第一节 受试物对DPPH自由基清除作用

第二节 受试物对超氧阴离子清除作用

第三节 受试物对羟自由基清除作用

第四节 受试物对NO自由基抑制作用

第五节 受试物总抗氧化能力的考察

第六节 受试物抗脂质过氧化能力的考察

参考文献

第二部分 红景天中八种苷（苷元）抗辐射作用的体外研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 目标抗辐射活性成分在Caco-2模型上的渗透及转运机制研究

第一节 Caco-2渗透模型的构建与评估

第二节 目标抗辐射活性成分对细胞单层毒性的考察及供侧浓度的确立1 实验材料

第三节 目标抗辐射活性成分的双向转运研究

结语

综述

个人简历

在读期间发表论文

致谢