褪黑素合成酶基因对烟草和贯叶连翘的转化及转基因植株抗氧化能力的增强

摘要

褪黑素(melatonin，MT)是在脊椎动物松果体(pinealbody)分泌的一种小分子的神经.内分泌(neuroendocfine)激素。褪黑素作为一种动物激素，可以调节脊椎动物生物节律和光周期反应，改善睡眠障碍，增强免疫等，并具有自由基清除剂和广谱抗氧化剂的作用。目前，在植物方面的褪黑素研究主要局限于对一些植物内源褪黑素含量的测定，对褪黑素在植物中的功能研究还刚刚开始，且报道很少，有关烟草(常用作转基因操作的模式植物)和中药植物贯叶连翘(Hpericum peratum L.)的转褪黑素合成关键酶基因报道尚未见到。 本研究通过根癌农杆菌介导的转化技术，将美国Vanderbilt大学Xu Yao博士馈赠的褪黑素生物合成酶……芳烷基胺N-乙酰转移酶(.ArylalkylamineN-acetyltransferase，AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(HydroxyindoleO-methyltransferase，HIOMT)基因，分别导入烟草和贯叶连翘中，获得了转基因植株，并测定和分析了两种转基因植物中褪黑素含量变化，以及外源基因在两种转基因植株中抗氧化方面的功能。所取得的主要研究结果如下：　　对含有AANAT-HIOMT。基因的植物表达载体YXu55进行了鉴定，发现质粒YXu55插入的AANAT基因序列与数据库AANAT基因序列(序列号：L140347)同源性为100％，HIOMT基因序列与数据库HIOMT基因序列(A型，序列号：U11090)的HIOMT基因型A-|5+7型相吻合，同源性为100％；A ANAT与HIOMT基因表达盒以顺式相连，并同方向与庆大霉素抗性基因表达盒串联，常用相关酶切位点多是多位点。 以叶片切块为外植体，通过不同激素配比的比较研究，建立了贯叶连翘的高效再生体系。在含有2,4.D1.0mg/L，NAA0.1mg/L的MS培养基上10～15d左右即形成愈伤组织且分化能力较强，在附加6-BA2.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS培养基上可以诱导出大量芽，分化率达100％，并形成丛生苗。将小苗在附加NAA0.2mg/L的MS培养基上培养10d后即可诱导出根。在根癌农杆菌介导的转化过程中，分别探讨了外植体预培养时间、pZPl22(仅含庆大霉素抗性标记，不含AANAT-HIOMT基因的空白质粒)和YXu55(含庆大霉素抗性标记和AANAT-HIOMT'基因)两种农杆菌浸染浓度、时间对烟草和贯叶连翘两种植物转化频率的影响。两种植物外植体分别预培养2～3d，在OD600=0.5的农杆菌菌液感染25min，而后分别在60mg/L和50mg/L的庆大霉素作选择压力下，获得了两种植物的阳性转基因植株。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR分析，证实褪黑素合成过程中关键酶基因AANAT-HIOMT已经整合到烟草和贯叶连翘两种植物基因组，并能够在转录水平上表达。 建立了检测植物褪黑素含量的反相高效液相色谱紫外检测(RP-HPLC)方法。色谱柱为SymmetryCt8(150mmx4.6mm，5.0gm)；流动相为100mmol/L乙酸铵：甲醇体积比80：20，检测波长为265.8nm；灵敏度为2.00A[5FS；流速为0.8mL.min-1时，褪黑素浓度在20～500ng-m. (R2=0.9992)范围内线性关系良好，平均加样回收率为98.09％(n=6)，RSD=2.21％，最小检出量为1.0ng.mL-1。褪黑素峰保留时间约为8min。　　通过RP-HPLC测定了烟草和贯叶连翘两种植物不同株系的转基因及其亲本(未转基因植株)的褪黑素含量，发现YXu55(含庆大霉素抗性标记和AANAT-HIOMT基因)转基因株系的褪黑素含量均高于pZPl22(仅含庆大霉素抗性标记，不含AANAT-HIOMT基因的空白质粒)转基因株系和未转基因的对照植株；而pZPl22转基因株系褪黑素含量跟未转基因的对照植株的含量几乎相等。 用褪黑素含量明显提高的不同转基因植物株系，分析了植物抗氧化系统的变化，初步得知褪黑素合成过程中的关键酶AANAT-HIOMT基因的导入使植物提高了抗氧化能力。与空白质粒pZPl22转化的植株和其亲本未转基因植株相比，转,mAN,AT-HIOMT基因的两种植物株系的总抗氧化能力均明显提高(P<0.05差异显著)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，过氧化氢酶(CAT)活性和谷胱甘肽(GSH)浓度也有所提高(P>0.05差异不显著)；而丙二醛(MDA)含量并未因外源基因的导入而发生改变(P>0.05差异不显著)。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.植物的遗传转化研究进展

1.1遗传转化的受体选择

1.2遗传转化的方法

1.3转基因植物中的标记基因

1.4外源基因在转基因后代中的遗传行为

1.5转基因植物的商业化生产

2.褪黑素的研究进展

2.1褪黑素的生物化学性质

2.2褪黑素的生理功能及意义

2.3植物中的褪黑素的研究进展

3.本研究的目的和意义

第二章 AANAT-HIOMT基因植物表达载体结构的验证

1.材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2.结果

2.1 pYXu55植物表达载体的验证

2.2测序结果及质粒图谱修正

3.讨论

第三章褪黑素合成酶基因对烟草(秦烟95)的遗传转化

1.材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2.结果与分析

2.1农杆菌介导的AANAT-HIOMT基因对烟草的遗传转化

2.2转基因植株的分子生物学鉴定

3.讨论

第四章贯叶连翘离体再生体系的建立及转褪黑素合成酶基因再生植株的获得

(一)贯叶连翘离体再生体系的建立

1.材料与方法

2.结果与分析

(二)贯叶连翘的遗传转化和转基因植株的获得

1.材料与方法

2.结果与分析

(三)本章讨论

第五章 RP-HPLC法测定转基因植株中褪黑激素含量

1.材料与方法

1.1仪器、材料与试剂

1.2溶液配制

1.3色谱条件

1.4褪黑素测定HPLC线性关系

1.5样品的测定

2.结果与分析

2.1色谱条件选择

2.2褪黑素测定的HPLC线性关系

2.3样品的测定

3.讨论

第六章转褪黑素合成酶基因植物的抗氧化系统变化

1.材料与方法

1.1仪器、材料与试剂

1.2方法

2.结果与分析

2.1超氧化物歧化酶(SOD)的活性

2.2过氧化物酶(POD)的活性

2.3过氧化氢酶(CAT)的活性

2.4丙二醛(MDA)含量变化

2.5谷胱甘肽(GSH)含量变化

2.6总抗氧化能力

3.讨论

论文主要结论、创新点与展望

参考文献

攻读博士学位期间的科研成果

致谢