秦艽AtNHX1基因转化及O-甲基转移酶基因克隆

摘要

龙胆科龙胆属植物秦艽是分布于我国西北地区的一种传统中草药，其主要次生代谢产物龙胆苦苷能够治疗风湿、疼痛和溃疡等症。正是由于秦艽具有重要的药用价值，它的野生种质资源已被过渡开采，生境也受到了严重的破坏。 本研究的目的是通过细胞工程手段为秦艽的保护和利用提供借鉴。拟在建立再生体系的基础上，通过转基因技术提高秦艽的抗盐性状。利用分子生物学手段，从秦艽中分离与抗逆相关的基因。 以秦艽叶片为外植体，通过组织培养方法探讨了秦艽离体再生的条件。 采用高效液相法测定秦艽愈伤组织以及各阶段体细胞胚中龙胆苦苷的含量，发现愈伤组织中不能检测到龙胆苦苷，球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶状胚中龙胆苦苷的含量分别为0.2609％、0.3282％、0.0285％和0.8062％(干重)。 通过农杆菌介导的遗传转化法将拟南芥液泡膜NaⅦ逆向转运蛋白基因.AtNHXl导入秦艽。将具有卡那霉素抗性的植株进行：PCR、RT-PCR以及实时定量PCR检测。对非转基因植株和转基因植株进行低浓度(5mmol/L)和高浓度(200mmol/L)NaCl处理，分析相对含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量等生理指标，发现非转基因秦艽对盐敏感，而转。4tNHXz基因秦艽的抗盐性有了很大提高，并且已经表现出耐盐植物的特性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1秦艽离体再生的研究

2抗盐基因遗传转化的研究

2.1植物遗传转化的方法

2.2植物抗盐基因工程

3 O-甲基转移酶基因的研究

第二章秦艽离体再生的研究

1材料和方法

1.1离体再生

1.2组织学观察

1.3植化分析

1.4数据统计

2结果

2.1离体再生

2.2组织学观察

2.3体细胞胚发生过程中龙胆苦苷的合成变化

3 讨论

3.1秦艽体细胞胚的发生

3.2组织学观察

3.3秦艽体细胞胚发育过程中龙胆苦苷合成的变化

第三章农杆菌介导的AtNHX1基因转化秦艽

1材料和方法

1.1实验材料

1.2农杆菌介导的遗传转化

1.3基因组DNA的提取

1.4质粒DNA提取

1.5 PCR检测

1.6 RT-PCR检测

1.7实时定量PCR分析

1.8生理生化指标的测定

1.9数据统计

2结果

2.1卡那霉素梯度筛选

2.2 PCR结果

2.3生理生化指标测定结果

3讨论

第四章秦艽O-甲基转移酶基因片段的分离

1材料和方法

1.1植物材料

1.2总RNA提取

1.3 mRNA纯化

1.4 3'-RACE

1.5 PCR产物的回收

1.6回收产物的连接

1.7大肠杆菌感受态细胞的制备

1.8连接产物的大肠杆菌转化

1.9重组质粒的提取

1.10重组质粒的酶切鉴定

1.11 DNA序列测定

2结果

2.1 3'-RACE反应结果

2.2重组质粒的PCR鉴定

2.3重组质粒的酶切鉴定

2.4 3'-RACE的序列分析

3讨论

参考文献

致谢