一个新铜绿假单胞菌质粒的分离鉴定及其温度敏感型衍生体的构建

摘要

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.PA)，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属的代表菌种，革兰阴性，在自然界分布广泛。铜绿假单胞菌是一种机会致病菌，它可以在人群中引起严重的急性和慢性感染，是病人在医院期间发生感染的第三大致病菌。许多抗生素对其具有一定的治疗作用，但铜绿假单胞菌对许多抗生素具有很高的内在抗药性。为了解决这一问题，需要从分子生物学水平更深入地开展研究。 质粒是一种相对简单的遗传物质，携带丰富的遗传信息，并且容易分离提纯和在体外进行操作，加上其相对独立，不影响宿主的生存，从而为深入研究DNA复制机理、基因的结构和功能，以及基因的表达和调控提供了良好的条件。 本研究于西安护城河中取水样，分离假单胞菌，进行质粒抽提。分离纯化一大小合适的质粒DNA片段，命名为pMMl。采用BamHI限制性酶切，胶回收酶切片段、与同样酶切的载体pUCl9连接，以M13通用引物为测序引物，通过引物步移(PrimerWalking)的方法进行测序。测序结果显示质粒pMMl全长2140bp，G+C含量为45.8％。 对质粒pMMl进行生物信息学分析，质粒。pMMl上存在着一个编码374个氨基酸、长为1125bp的开放阅读框(ORF 742bp.1683bp)，并且此ORF与质粒滚环复制(RCR)'VIII家族Rep氨基酸编码序列同源，推断此ORF为Rep蛋白编码区。利用基于计算法和热力学知识预测RNA/DNA核苷酸二级结构杂交和解链结构的软件确定出参与复制的SSO和dso区。pMMl具备质粒滚环复制(RCR)VIII家族的所有性质特征，推测其复制类型属于(RCR)VIII家族，为铜绿假单胞菌的一个新型隐秘质粒。 利用error-prone PCR体外突变方法，突变pMMl，构建出一个在30。C生长而在42。C不长的温度敏感型铜绿假单胞菌载体pMM8，将此载体克隆进pUCl9的多克隆位点，得到大肠杆菌、铜绿假单胞菌穿梭载体pUM8。对温敏质粒pMM8测序，结果显示参与复制的S80和出D区分别有一处碱基发生突变。利用pUM8质粒载体通过基因同源重组的方法成功敲除了铜绿假单胞菌的PA3899基因。这一铜绿假单胞菌温度敏感载体pUM8为进一步从分子生物学水平研究铜绿假单胞菌提供了技术支持。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略用语

声明

第一部分前言

1.1铜绿假单胞菌的性质及危害

1.2细菌质粒的基本特征

1.2.1质粒的不相容性及质粒拷贝数

1.2.2质粒的稳定性

1.2.3细菌质粒复制机制研究

1.3重组质粒载体的应用

1.4研究目的和意义

第二部分实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2培养基的配置

2.1.3试剂

2.1.4仪器

2.2实验方法

2.2.1质粒的小量提取

2.2.2细菌基因组DNA的提取

2.2.3感受态细胞的制备

2.2.4电转化

2.2.5质粒或DNA片段的酶切和连接

2.2.6聚合酶链式反应(PCR)

2.2.7假单胞菌的分离及质粒提取

2.2.8穿梭载体pUM1的构建及pMM1质粒序列测定

2.2.9温度敏感载体pUM8的构建

2.2.10温度敏感载体pUM8质粒稳定性的测定

2.2.11温度敏感载体pUM8质粒的序列测定及分析

2.2.12利用温度敏感载体pUM8进行PA3899的敲除试验

第三部分实验结果

3.1假单胞菌的分离及质粒的提取结果

3.1.1假单胞菌的分离

3.1.2假单胞菌质粒的提取

3.2构建穿梭载体pUM1

3.3 pMM1质粒序列测定及序列分析

3.3.1 pMM1序列测定

3.3.2 pMM1序列分析

3.4构建温度敏感载体pUM8

3.5测试温度敏感载体pUM8的质粒稳定性

3.6温度敏感载体pMM8突变位点的分析

3.7 PA3899基因敲除实验

第四部分讨论

参考文献

附录

致谢