蛋白折叠液相色谱法用于对还原变性牛胰岛素折叠行为的研究

摘要

高效液相色谱不仅用于生物大分子的分离，也是蛋白折叠研究的重要手段，已发展成为蛋白折叠液相色谱法。本文利用疏水色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱分别对还原变性牛胰岛素进行了折叠研究，采用反相色谱、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)及光谱学方法对折叠后的组分进行分离和检测。 本文在综述部分对蛋白复性的原理、蛋白复性的方法进行了阐述和比较，以及LC对蛋白复性的贡献和二硫键的折叠研究方面的进展做了全面的概述，并简要介绍了本研究的目的及研究策略。 首先利用疏水色谱法(HIC)对还原变性牛胰岛素的折叠行为进行了研究，详细研究了流动相中脲浓度、谷胱甘肽氧化还原剂对对还原变性胰岛素折叠行为的影响。发现复性流动相中加入低浓度的脲能够有效抑制还原变性胰岛素的聚集沉淀，而GSH/GSSG的加入能够参与二硫键的对接反应。但是通过MALDI—TOF MS检测发现，由于GSH、GSSG修饰到胰岛素的两条多肽链上，使胰岛素链间二硫键的对接反应受到了影响，复性效率提高不明显。通过脲浓度及GSH/GSSG条件的优化，还原变性胰岛素复性后的质量回收率从普通流动相时的零提高到3.5％。另外，研究了不同疏水强度的疏水柱(疏水端基分别为PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000)对还原变性牛胰岛素复性的影响，以疏水强度适中的PEG-600效果最好。最后对还原变性牛胰岛素在HIC色谱上的动力学行为进行了研究。实验表明还原变性胰岛素在柱子上的停留时间对其折叠行为有影响，随着时间的延长，复性效率有所提高，但效果不明显。 然后利用离子交换色谱法(IEC)对还原变性牛胰岛素的折叠行为进行了研究，采用弱阴离子交换色谱法(WAX)对还原变性胰岛素的折叠行为进行了研究。考察了流动相中脲浓度、不同氧化还原体系( GSH/GSSG、Cyst/GSSG、Cyst)及不同氧化还原剂对的浓度比率对还原变性胰岛素复性的影响。当流动相中添加3 mol/L的脲以及浓度比例为6：1的Cyst/GSSG时，还原变性胰岛素的复性效果最好，质量回收率达到了10.6％。另外，本章还研究了WAX采用线性脲梯度洗脱的方式时对还原变性胰岛素折叠的影响。通过不同梯度的选择，复性后胰岛素的质量回收率提高到了13.3％。最后，同时采用氧化还原剂及脲梯度对IEC复性还原变性胰岛素进行了研究，质量回收率进一步提高，此时达到了15.6％，并且通过质谱与光谱的检测，发现在此过程中形成了分子量与天然胰岛素相同但是RPLC上保留时间不同的稳定的中间体，此中间体的质量回收率为17.9％，所以在此条件下，胰岛素二硫键的正确对接率达到了33.5％。 最后，利用了体积排阻色谱法(SEC)对还原变性牛胰岛素的折叠行为进行了研究，首先对非氧化型流动相的SEC法和氧化型流动相的SEC法复性还原变性胰岛素分别进行了研究，发现非氧化型SEC几乎不能使还原变性胰岛素得到复性，而添加了浓度比为6：1的Cyst/GSSG后，还原变性胰岛素复性后的质量回收率达到了4.2％。此外，利用氧化型流动相脲梯度凝胶过滤复性方法对还原变性胰岛素的复性进行了研究，发现胰岛素的复性效率并没有明显提高，大量的胰岛素A链和B链分别与流动相中的小分子结合，使复性回收率的提高受到了限制。在本章中还对以上三种不同的蛋白折叠液相色谱法复性还原变性胰岛素进行了比较，以IEC法效果最佳，而HIC的效果是最差的。并对导致胰岛素复性效率低的原因做了比较详细的讨论。 本文分别利用疏水色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱分别对还原变性牛胰岛素的折叠行为进行了研究，并考察了多种影响因素对其二硫键正确对接的影响。如流动相中的脲浓度、固定相、不同氧化还原体系、动力学影响、脲梯度等。利用弱阴离子交换色谱法在最优化条件下可使还原变性牛胰岛素的二硫键对接率由2.6％提高到33.5％。本研究还为还原变性的双链蛋白的折叠建立了一种新的检测方法，尤其是对于生物活性检测受到限制的蛋白，利用MALDI—TOF MS检测其分子量，便能得出双链蛋白链间的二硫键是否配对，再结合光谱法即可判断出折叠后的蛋白是否恢复到了其天然态构象。这种检测方法既具有操作简单的优点，而且因为MALDI—TOF MS的高灵敏度高分辨率，检测结果也很准确。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1蛋白质的变性与复性

1.1.1蛋白质的变性

1.1.2蛋白质的复性

1.1.3蛋白质的折叠机理

1.2蛋白质的复性方法

1.2.1传统的复性方法

1.2.2添加稀释复性法

1.2.3分子伴侣及人工分子伴侣辅助复性

1.2.4相分配、反胶束蛋白再折叠

1.2.5蛋白折叠液相色谱

1.3蛋白折叠液相色谱法在蛋白复性中的应用

1.3.1 HIC

1.3.2 IEC

1.3.3 SEC

1.3.4 AFC

1.4含二硫键蛋白的折叠

1.5本课题的研究目的与研究策略

参考文献

第二章疏水色谱法对还原变性牛胰岛素折叠行为的研究

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1仪器

2.2.2试剂

2.2.3还原变性Ins的制备

2.2.4 HIC色谱条件

2.2.5 RPLC色谱条件

2.2.6 MALDI-TOF MS检测

2.3结果与讨论

2.3.1 RPLC对标准蛋白的分离

2.3.2 RPLC对还原变性胰岛素分离的优化

2.3.3 RPLC对还原变性胰岛素的分离与MALDI-TOF MS检测

2.3.4 HIC对还原变性胰岛素分离

2.3.5脲浓度对还原变性Ins在HIC上折叠行为的影响

2.3.6 GSH/GSSG的浓度比率对还原变性Ins在HIC上折叠行为的影响

2.3.7固定相疏水性强度对还原变性Ins复性的影响

2.3.8还原变性Ins在疏水色谱上的动力学研究

2.4小结

参考文献

第三章离子交换色谱法对还原变性牛胰岛素折叠行为的研究

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1仪器

3.2.2试剂

3.2.3还原变性Ins的制备

3.2.4 IEC色谱条件

3.2.5反相色谱条件

3.2.6 MALDI-TOF MS检测

3.3结果与讨论

3.3.1脲浓度对还原脲变性Ins在WAX柱上色谱行为的影响

3.3.2不同氧化还原体系对还原变性Ins复性的影响

3.3.3脲梯度对WAX复性还原变性Ins的影响

3.3.4氧化还原剂与脲梯度的同时作用

3.3.5光谱检验

3.4小结

参考文献

第四章体积排阻色谱法对还原变性牛胰岛素折叠行为的研究

4.1前言

4.2脲梯度SEC

4.3实验部分

4.3.1仪器

4.3.2试剂

4.3.3还原变性Ins的制备

4.3.4 SEC色谱条件

4.3.5 RPLC色谱条件

4.3.6 MALDI-TOF MS检测

4.4结果与讨论

4.4.1非氧化型流动相SEC对还原变性Ins的复性

4.4.2氧化型流动相SEC对还原变性Ins的复性

4.4.3氧化型流动相脲梯度SEC复性还原变性Ins

4.4三种液相色谱法对还原变性Ins折叠的比较

4.5小结

参考文献

结论

硕士期间发表论文

致谢