两步柱色谱法分离纯化重组猪β-肾上腺素能受体

摘要

β2-肾上腺素能受体(β2-AR)是细胞表面受体的一种，它能通过偶联异源三聚体G蛋白将信号转导引入到细胞内部，参与机体的许多生理和病理过程，是某些药物作用的主要靶标。利用β2-AR与药物有效成分特异性结合的能力，可以对药物中的活性成分进行有效的筛选，而获取高纯度的β2-AR是整个受体筛药的前提。
　　 在前期克隆和表达β2-AR的基础上，本实验建立了一种两步柱色谱分离纯化β2-AR的方法。首先用Ni2+螯合的SepharoseH.P.与含有组氨酸标签的β2-AR特异结合的性质对其进行初步分离，层析缓冲液：A液为20.0mmol/LPB+500.0mmol/LNaCl(pH7.4)，B液为含500.0mmol/L咪唑的A液。用0.0、50.0、250.0和500.0mmol/L咪唑进行分段洗脱后得到三个蛋白峰，经过SDS-PAGE分析，含有β2-AR蛋白的组分中仍然含有杂蛋白。在此基础上，再用QuatemarySepharoseF.F.对其进行进一步分离纯化，层析缓冲液：A液为20.0mmol/LPB(pH7.4)，B液为含有800.0mmol/LNaCl的A液。用A液+18％B液平衡色谱柱后进行线性梯度洗脱，梯度为A液+18％B液到100％B液，总洗脱体积为30mL。最终获得五个蛋白峰，含有β2-AR的组分经SDS-PAGE和高效凝胶排阻色谱检测其纯度约为95％，再经受体-配体结合法检测表明获得的β2-AR具有正常生物活性。结果表明：经过Ni2+螯合的SepharoseH.P.亲和层析与QuaternarySepharoseF.F.强阴离子层析可以对重组β2-AR进行有效分离。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1受体研究概述

1.1.1肾上腺素能受体分类

1.1.2肾上腺素受体的结构与功能

1.1.3β-AR的结构与功能

1.1.4β2-AR的分离纯化研究进展

1.2本论文的研究内容、目的及意义

1.2.1研究内容

1.2.2研究目的和流程

1.2.3研究意义

第二章β2-AR融合蛋白的诱导表达与分析

2.1引言

2.2实验材料和方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验步骤及方法

2.3实验结果及讨论

2.3.1诱导后蛋白表达结果及讨论

2.3.2破碎后离心所得沉淀处理结果及讨论

第三章β2-AR融合蛋白的柱层析

3.1引言

3.1.1亲和层析

3.1.2离子交换层析

3.1.3凝胶排阻层析

3.1.4疏水作用层析

3.2实验材料和方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验步骤及方法

3.3实验结果与讨论

3.3.1 Ni2+亲和层析结果及讨论

3.3.2凝胶排阻层析结果及讨论

3.3.3阳离子交换层析结果及讨论

3.3.4阴离子交换层析结果及讨论

3.3.5蛋白浓度及回收率测量结果

第四章 目的蛋白的纯度检测

4.1引言

4.2实验材料和步骤

4.2.1实验材料

4.2.2使用Shim-pack Diol-300柱对目的蛋白组分进行纯度检测

4.2.3对目的蛋白进行活性检测

4.3实验结果及讨论

4.3.1目的蛋白纯度检测结果

4.3.2目的蛋白活性检测结果

第五章总结与展望

5.1实验总结与创新

5.2展望

参考文献

攻读硕士期间论文完成情况

致谢