Ⅰ.NRSF基因沉默促进干细胞向胰岛β样细胞分化的研究;Ⅱ.小分子化合物Me6对辐射损伤组织的修复作用及其机制的研究

摘要

糖尿病是严重危害人类健康与生活质量的疾病之一,Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型糖尿病晚期均以皮下注射外源性胰岛素治疗为主,但外源性胰岛素疗效并不十分理想。近些年来,胰腺的移植在临床上得到了广泛的应用,胰腺的移植可以在一定程度上改善糖尿病的并发症,并且可以在一定程度上恢复血糖的动态平衡,然而其手术复杂,并且具有一定的风险性。胰岛细胞移植也是近几年来发展起来的一种新方法,它以分子生物学、免疫生物学及生物工程学为基础,相比胰腺移植而言,胰岛移植更加简单、安全,并且创伤小,恢复快,同时也可以在体外进行修饰,所以胰岛细胞移植成为了糖尿病治疗的热点。然而胰岛细胞的供体较少,数量有限,不能满足临床应用的需要,于是人们开始寻找胰岛细胞的可替代资源。干细胞是一类具有无限增殖能力及多向分化潜能的细胞,可以分化为三个胚层来源的多种组织细胞,在一定的诱导条件下可以被诱导成为包括胰岛细胞在内的多种细胞。然而近年来,国内外的研究及我们的实验结果表明来源不同的干细胞分化为胰岛β细胞使用的诱导方案虽然有所不同,但却面临相似的问题,即诱导的细胞很难体外分化成熟,多为胰岛前体细胞,同时表达几种标志,这些细胞移植体内需要较长时间分化成熟。因此,深入研究胰岛细胞发育成熟的分子机制,进一步寻找高效稳定的促进胰岛细胞分化成熟的新方案仍是目前的研究热点。
　　在胰岛细胞的发育过程中,很多转录因子时空表达决定了胰岛细胞的分化成熟,如PDX-1、Neurogenin3、NeuroD、Pax4等。近年来的研究表明,NRSF参与调控成熟胰岛细胞的胰岛素分泌功能。Abderrahmani等人的研究表明NRSF过表达的胰岛素瘤细胞系,其葡萄糖-胰岛素分泌耦联机制受到破坏。深入研究发现神经特异蛋白complexin I调控了胰岛细胞葡萄糖诱导的胰岛素释放功能,而complexinI的表达则受到NRSF的转录负调控。Martin等制作了胰岛细胞特异性过表达NRSF的转基因(胰岛素启动子-NRSF)小鼠,检测结果表明这些转基因小鼠的胰岛β细胞数量减少,胰腺总胰岛素含量减少两倍;由于其胰岛素分泌能力受损,所以这些小鼠也不能耐受高浓度的葡萄糖。深入研究发现参与调控胞吐作用的基因表达明显受到抑制,如SNAP25、SYTIV、SYTVII、SYTIX、complexinII等。这些研究结果提示NRSF参与调控了胰岛细胞的功能。我们近期发表的研究结果表明,可卡因-安非他明调节的转录本(Cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)基因也受到NRSF的调控。该基因主要表达于神经内分泌细胞中,如神经元、垂体细胞、胰岛细胞等。有研究表明CART基因参与调控了葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能。此外,我们还发现NRSF直接调控了人胰岛素基因的表达,人胰岛素启动子内存在NRSE序列,NRSF蛋白能与该序列结合并抑制人胰岛素启动子的转录活性。NRSF的下调表达会明显上调胰岛素启动子的转录活性。以上的研究结果提示我们:NRSF在胰岛β细胞中的消失可能是建立完全分化成熟、具有完好分泌反应的胰岛细胞所必需的。
　　羊水往往是被人们作为医疗垃圾而丢弃的,然而羊水中也存在着大量的干细胞,在本文中,我们从羊水中分离出了羊水干细胞(AFSCs),并且对其进行了相关鉴定,表面其可以表达干细胞的表面标志SSEA-4、Nanog、Oct4等,同时我们也对其分化能力进行了鉴定,发现其可以向骨、神经及肝样细胞分化。
　　然后,我们将NRSF干涉载体用慢病毒的方式转入羊水干细胞中,发现NRSF沉默表达后,胰岛相关基因Pax4及Insulin的表达明显升高,分别升高了约4.5倍、19.2倍。我们进一步对NRSF沉默表达的羊水干细胞进行两步法的诱导,发现在诱导的第7天时,细胞呈上皮样生长,在14天时已有部分细胞呈球状生长,与胰岛细胞的特性相似。通过对诱导的细胞进行干细胞表面标志的检测发现,该细胞已经失去了干细胞的特性,反而表达胰岛细胞的表面标志Pdx1、Insulin、C-peptide。用qRT-PCR的方法证实,NRSF沉默表达后,胰岛相关基因的表达明显的升高。
　　NRSF促进干细胞向胰岛细胞分化,可能与其负性调控胰岛相关的靶基因有关。文献调研发现CART基因在胰岛细胞的糖反应性调节方面发挥重要作用。因此,我们推测NRSF可能调控了该基因。通过siRNA的实验我们发现,NRSF与CoREST、HDAC1、mSin3A共抑制蛋白共同参与了CART基因的转录调控。我们在细胞中过表达NRSF、CoREST、HDAC1、mSin3A基因,同样证实了CART基因转录调控过程中NRSF及共抑制因子CoREST、HDAC1、mSin3A扮演着重要的角色。随后我们又通过荧光素酶报告系统实验证实,NRSF是通过与CART基因启动子、内含子区NRSE结合后,招募形成相似但不相同的转录抑制复合体,发挥对CART基因的精密调控。通过这部分实验,我们对NRSF沉默表达能够促进干细胞向胰岛样细胞分化的机制有了很好的认识。

目录

封面

声明

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分：羊水干细胞的分离及鉴定

实验材料与实验方法

实验结果

小结

第二部分：NRSF沉默表达促进羊水干细胞向胰岛β样细胞分化

实验材料与实验方法

实验结果

小结

第三部分：NRSF基因沉默促进干细胞向胰岛β样细胞分化的机制探讨

实验材料与实验方法

实验结果

小结

讨 论

结 论

参考文献

Ⅱ. 小分子化合物Me6对辐射损伤组织的修复作用及其机制的研究

中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分：小分子化合物Me6对造血干/祖细胞的动员及促增殖作用的研究

实验材料与实验方法

实验结果

小结

第二部分：小分子化合物Me6促进辐射损伤小鼠造血系统再生

实验材料及实验方法

实验结果

小 结

第三部分：小分子化合物Me6促进辐射损伤小鼠小肠组织再生

实验材料及实验方法

实验结果

小结

讨 论

结 论

附 录

与学位论文相关的该研究领域文献综述（全文）

在学期间发表的代表性论著（全文）

个人简历

致谢