布鲁杆菌Ⅱ型MEP合酶的制备表征及其催化机制的初步探索研究

摘要

背景:随着抗生素耐药性问题不断加剧，对多种疾病可选用的治疗办法正在耗尽，临床上迫切需要新型抗生素的研究与开发。类异戊二烯化合物合成过程中的关键酶2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)合成酶，又称1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR)是最有前景的抗生素筛选靶标之一。以DXR为靶点筛选的抗生素膦胺霉素具有用于治疗由多重耐药菌和恶性疟原虫(Plasmodium)引起的感染的潜力。最新的研究发现一些主要致病菌如巴尔通体属（Bartonella）和布鲁杆菌属（Brucella）的菌体内不存在DXR蛋白，而是被一种DRL酶(DXR-like，或称Ⅱ型DXR)所替代。虽然DRL与DXR的功能相同，但是两者无论是在系统发生树还是在晶体结构上都具有明显的差异。因此有可能针对BaDRL筛选一批抗菌谱窄、特异性强的抗菌化合物。
　　内容:本文首先成功构建了E.coli BL21(DE3)-BaDRL工程菌株，对其进行诱导表达布鲁杆菌源BaDRL。使用常规IPTG诱导时，BaDRL表现出菌体产量低，酶活性不高等问题;通过进一步优化培养条件，使用自诱导方式培养不仅解决了菌体产量低的情况而且获得的酶活力大大增强。其次，以葡萄糖为原料模拟体内糖酵解途径，采用“一锅法”酶法合成了纯度较高的DRL底物DXP，用于研究BaDRL催化机制。最后，利用羰基化合物中的羰基与溶剂H2O交换氧原子这一现象，在H218O中进行DRL催化DXP向MEP转化的反应，通过分析产物MEP的18O标记位置和相对丰度，推测酶BaDRL催化DXP转化过程中与底物DXP可能的结合方式。
　　结果:通过优化改进目的蛋白BaDRL诱导条件，得到了产量高（约10g菌体沉淀/500mL LB培养基）、纯度好、活性良好的BaDRL。BaDRL最适pH范围是7-9，温度是40℃，同时我们还测定了BaDRL的稳态动力学参数。18O标记实验结果证明标记产物为[2-18O]MEP，推测DRL酶与底物DXP可能是通过DXP的C3-C4位方式结合的。

目录

声明

摘要

缩略语对照表

第一章 绪论

1．1 MEP途径概述

1．1．2 MEP途径中的关键酶

1．1．3 MEP途径是潜在的药物靶点

1．2 MEP途径中的DRL酶

1．2．1 BaDRL的发现

1．2．2 BaDRL的晶体结构

1．3 利用DRL的细菌

1．3．1 巴尔通体

1．3．2 布鲁杆菌

1．4 本研究的意义

第二章 IPTG诱导BaDRL的表达、纯化及酶学表征

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 溶液配方

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的构建

2．2．2 BaDRL的IPTG诱导表达

2．2．3 BaDRL的纯化

2．2．4 BaDRL的SDS-PAGE检测

2．2．5 BaDRL的浓度测定

2．2．6 BaDRL的活性鉴定

2．2．7 BaDRL的稳态动力学参数测定

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 菌株的构建结果

2．3．2 BaDRL的IPTG诱导表达结果

2．3．3 BaDRL的纯化与SDS-PAGE检测结果

2．3．4 BaDRL的浓度测定结果

2．3．5 BaDRL的活性鉴定结果

2．3．6 BaDRL的稳态动力学参数测定结果

2．4 本章小结

第三章 自诱导BaDRL的表达、纯化及酶学表征

3．1 引言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 菌株

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要溶液配方

3．2．4 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 BaDRL的自诱导表达

3．3．2 BaDRL的纯化

3．3．5 BaDRL的反应条件优化

3．3．6 BaDRL稳态动力学参数测定

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 BaDRL的自诱导表达结果

3．4．2 BaDRL的纯化与SDS-PAGE鉴定结果

3．4．3 DRL的浓度测定结果

3．4．4 BaDRL反应条件优化结果

3．4．5 BaDRL动力学参数测定结果

3．5 本章小结

4．1 引言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 菌株

4．2．2 试剂

4．2．3 主要溶液配方

4．2．4 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 EcDXS和EcDXR的表达纯化和活性鉴定

4．3．2 DXP的合成

4．3．3 18O标记MEP的合成

4．3．4 13C标记DXP的合成

4．3．5 标记底物DXP和MEP结构鉴定

4．4 实验结果

4．4．1 DXP的合成结果

4．4．2 18O标记MEP的合成结果

4．4．3 13C标记DXP的合成结果

4．5 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的科研成果