磷酸盐浓度对铜绿假单胞菌PAO1产鼠李糖脂及其基因表达的影响

摘要

鼠李糖脂是近年来受到广泛关注的生物表面活性剂之一，因应用范围广以及环境友好等特点，使其成为潜在的合成表面活性剂的替代品。然而，鼠李糖脂的生产存在产量低、规模小以及成本高等问题，大大限制了其在工业规模上的使用。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是发酵生产鼠李糖脂最理想的菌株之一，但其鼠李糖脂的生物合成受到环境因子、营养因素以及复杂基因调控的影响，其中基因表达调控QS系统（rhl系统、las系统和pqs系统）的作用又与环境因子以及营养因素密切相关。
　　本研究以铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1为对象，采用Plackett-Burman(PB)设计和响应曲面方法(RSM)对其产鼠李糖脂的发酵条件进行多因素优化。PB试验设计显示磷酸盐浓度、pH值和C/N比3个因素对鼠李糖脂的产量具有显著影响，其中最显著的影响因素是磷酸盐浓度;通过RSM对3个显著因素的最佳水平范围进行分析，结果表明当磷酸盐浓度为1.71g/L、pH值为6.0、C/N比为15.5时，菌株PAO1合成鼠李糖脂的产量可高达20.72g/L，比优化前鼠李糖脂产量12.63g/L提高了64.05％，很接近理论预测值21.35g/L。在此基础上，选取最显著影响因素磷酸盐浓度，研究不同磷酸盐浓度对菌株PAO1合成鼠李糖脂的影响，结果发现当磷酸盐浓度为0.01-0.5g/L（即低磷浓度）时，其鼠李糖脂的产量比最佳水平磷酸盐浓度时的产量高;尤其当磷酸盐浓度为0.5g/L时，鼠李糖脂产量最高达到24.93g/L。但是，当培养基中不含磷酸盐时，鼠李糖脂的产量仅有16.86g/L。血平板实验显示在磷酸盐浓度为0.5g/L时溶血圈最大，与鼠李糖脂的产量结果一致;SDS-PAGE凝胶电泳分析发现菌株PAO1在不同磷酸盐浓度下有相应的差异蛋白表达。采用qPCR的方法，对不同磷酸盐浓度下rhl系统、las系统以及双组份调控系统相关基因的相对表达量进行测定。结果显示:rhlI、rhlR、lasI、lasR、rsaL、phoB、phoR基因的相对表达量均发生明显的变化。由此可见，不同磷酸盐浓度对铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂及其基因表达调控有影响。
　　为了进一步探究铜绿假单胞菌在不同磷酸盐浓度下对鼠李糖脂合成的影响，构建了rhl系统突变菌（△rhlI、△rhlR）和las系统突变菌(△lasI、△lasR、△rsaL)，分别对其在不同磷酸盐浓度下鼠李糖脂的产量及其相关基因的表达调控进行研究。结果表明:在低磷条件下，△rhlI玎和△rhlR的鼠李糖脂产量(18.35g/L和16.04g/L)相比PAO1的产量(24.93g/L)分别下降了26.39％和35.66％，△lasI和△lasR的鼠李糖脂产量变化不明显，尤其是△lasI在此条件下的合成量(23.3g/L)与PAO1的产量几乎一致，而△rsaL的鼠李糖脂产量(28.36g/L)比PAO1的产量提高了13.88％。qPCR结果显示:rhl系统突变菌中rhlA、rhlB基因的相对表达量较低，但△lasI和△lasR中rhlA、rhlB基因的相对表达并未受到太大影响，而△rsaL中rhlA、rhlB基因的相对表达升高;rhl系统突变菌和△rsaL中phoB、phoR基因的相对表达量下降，△lasI和△lasR中相对表达量无明显变化。在无磷条件下，△rhlR和△lasR的鼠李糖脂产量(12.86g/L和13.02g/L)相比野生菌PAO1的产量(16.86g/L)分别下降了15.79％和22.78％，△rhlI和△lasI在此条件下的鼠李糖脂合成量与野生菌的产量一致，而△rsaL的产量(20.12g/L)比PAO1的产量提高了19.34％。qPCR结果显示，△lasR和△rhlR中基因rhlA、rhlB的相对表达量有明显的下调，而△rsaL中表达量明显上调;phoB、phoR基因的相对表达量在各菌株中几乎不变。由此可见，低磷条件下，rhl系统在鼠李糖脂合成和调控中起关键作用，双组份调控系统也参与了鼠李糖脂的调控;无磷条件下，rhl系统中的rhlR基因和las系统中的lasR基因在鼠李糖脂生物合成及基因表达调控中起主要作用，而双组份调控系统不参与调控鼠李糖脂的合成;rsaL基因作为las系统的抑制子，会抑制鼠李糖脂的合成。因此，鼠李糖脂的合成及其基因表达调控受到了营养因素的影响;在不同磷酸盐条件下，铜绿假单胞菌适应环境的应答机制有所差异，能直接或间接影响鼠李糖脂的合成。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

缩写对比表

第一章 绪论

1．1 生物表面活性剂的概述

1．1．1 生物表面活性剂的来源

1．1．2 生物表面活性剂的分类

1．1．3 生物表面活性剂的应用

1．2 鼠李糖脂的研究进展

1．2．1 鼠李糖脂的化学结构

1．2．2 鼠李糖脂的性能

1．2．3 鼠李糖脂的应用及发展趋势

1．3 铜绿假单胞菌合成鼠李糖脂的研究进展

1．3．1 鼠李糖脂的生物合成

1．3．2 鼠李糖脂合成的基因调控

1．3．3 培养基组分对合成鼠李糖脂的影响

1．4 本论文的研究内容及意义

第二章 实验材料及方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 培养基的配制

2．1．5 试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 PB(Plackett-Burman)试验设计

2．2．2 响应曲面法试验设计

2．2．3 鼠李糖脂的测定

2．2．4 基因敲除载体的构建

2．2．5 三亲株杂交

2．2．6 质粒提取

2．2．7 DNA片段纯化回收

2．2．8 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

2．2．9 DNA酶切反应

2．2．10 DNA连接反应

2．2．11 聚合酶链式反应(PCR)反应体系

2．2．12 细菌RNA的提取

2．2．13 细菌RNA的反转录

2．2．14 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．2．15 荧光实时定量PCR(qPCR)

第三章 实验结果

3．1 培养基组成的优化

3．1．1 PB试验结果与分析

3．1．2 RSM试验结果

3．1．3 RSM分析与优化

3．1．4 试验结果验证

3．2 不同磷酸盐浓度对铜绿假单胞菌PAO1合成鼠李糖脂的影响

3．2．1 菌株PAO1在不同磷酸盐浓度下鼠李糖脂的产量

3．2．2 铜绿假单胞菌PAO1在不同磷酸盐浓度下相关基因的差异表达

3．3 突变菌株的构建以及不同磷酸盐浓度对其产鼠李糖脂的影响

3．3．1 突变菌株的构建

3．3．2 rhl系统突变菌在不同磷酸盐浓度下鼠李糖脂的产量

3．3．3 las系统突变菌在不同磷酸盐浓度下鼠李糖脂的产量

3．3．4 不同磷酸盐浓度下鼠李糖脂合成相关基因的差异表达

3．4 讨论

小结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的科研成果