全氟异丁烯急性吸入性肺损伤的病理机制研究

摘要

作为重要的化工原料和副产物,全氟异丁烯(perfluoroisobutylene,PFIB)是一种常温下为气态的无色无味低分子量的高氟有机物,能穿透普通防毒面具,且无特效的防治措施,是常见的可引起急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury,ALI/acute respiratory distress syndrome,ARDS)的有毒化学品。
　　目前,对PFIB所致ALI的发病机制研究认为直接氧化损伤可能是PFIB致病的重要机制之一;同时,多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)介导的过度炎症反应可能是PFIB致病的另一重要机制。同时,肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)参与PMN介导的PFIB急性吸入性肺损伤,并与PMN在肺内的扣押有关。PFIB急性吸入后可激活肺组织内多种细胞,尤其是间接激活AM内核因子κB(nuclear factor-ha,NF-κB),进而诱导AM表达多种致炎因子,这些致炎因子对PMN具有强烈的激活和趋化活性,但有关PFIB通过何种机制激活NF-κB仍不清楚,PFIB急性吸入性肺损伤的机制研究仍有待完善。
　　一、内源性血管紧张素II在PFIB急性吸入性肺损伤中的作用
　　近年研究发现,肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在ALI/ARDS的发生、发展中发挥重要作用。血管紧张素II(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)作为RAS的主要效应物质不仅是重要的体液调节因子参与调节血液循环,而且还是重要的前炎症因子,可上调NF-κB活性,增加白介素-8(Interleukin-8,IL-8)、白介素-1β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子的表达释放,引发炎症反应。而血管紧张素转换酶(angiotensin convert enzyme,ACE)/血管紧张素转换酶2(angiotensin convert enzyme 2,ACE2)分别作为AngⅡ的正/负性调节酶影响ALI的进程。减少AngⅡ的生成或阻断AngⅡ受体均可减轻多种原因所致的肺损伤。AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中的作用如何,它是否作为PFIB急性吸入性肺损伤的始动因素激活NF-κB进而介导PFIB急性吸入性肺损伤,目前尚未见文献报道。本文的研究目的之一即是对上述问题进行初步探讨。
　　1、观察PFIB吸入染毒后,大鼠肺组织AngⅡ含量及其调节酶ACE的蛋白表达水平、酶活性与肺损伤程度的时间变化关系:大鼠PFIB急性吸入染毒后,肺系数、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)总蛋白含量和肺组织病理学检查等指标均显示肺损伤程度逐渐加重,至染毒后16h达峰值,染毒后24h明显缓解,因此确定本实验成功复制了大鼠PFIB急性吸入染毒病理模型。在此基础上,采用放射免疫分析方法检测PFIB染毒后大鼠的血液和肺组织匀浆中AngⅡ含量随时间的变化:血浆和肺组织中AngⅡ含量均呈现先升高后降低的变化趋势,其中肺组织AngⅡ含量在染毒后16h、24h较空白对照组显著降低。血浆AngⅡ含量与肺组织中AngⅡ变化趋势基本一致,但各时间点均无统计学差异;采用紫外线吸收法检测肺组织ACE酶活性随时间的变化:PFIB染毒后肺组织ACE活性在一定范围内波动,但各时间点无统计学差异。分析结果,肺组织AngⅡ含量和ACE酶活性的变化与肺损伤程度无明显的时间关联性,提示AngⅡ在大鼠PFIB急性吸入性肺损伤的发生、发展中可能不具有重要的病理学意义。
　　2、针对RAS发挥病理生理作用的最关键成分AngⅡ,选择AngⅡ的AngⅡ1型受体(angiotension Ⅱ type 1 receptor,AT1-R)阻断剂氯沙坦,从时间-效应和剂量-效应两个方面考察AngⅡ在大鼠PFIB急性肺损伤中的作用:
　　①时间-效应关系,PFIB染毒对照组大鼠的各项肺系数和BALF总蛋白含量较溶剂对照组显著升高,说明染毒模型建立成功。但不同时间给予氯沙坦(分别在PFIB染毒前1h、染毒前0.5h、染毒后0.5h、染毒后1h、染毒后2h、染毒后4h和染毒后8h腹腔注射氯沙坦10mg/kg)阻断AngⅡ受体进行预防或治疗,各组大鼠肺系数和BALF总蛋白含量与染毒对照组比较没有显著性差异。
　　②剂量-效应关系,PFIB染毒对照组大鼠的各项肺系数和BALF总蛋白含量显著高于溶剂对照组,说明染毒模型建立成功。但给予不同剂量氯沙坦(分别在PFIB染毒前1h腹腔注射氯沙坦1.25、2.5、5、10和15mg/kg)阻断AngⅡ受体进行预防,各组大鼠肺系数和BALF总蛋白含量与染毒对照组比较没有显著性差异。以上结果表明,不同给药时间和不同给药剂量给予氯沙坦阻断AT1-R对PFIB急性肺损伤的影响微弱,进一步提示AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中可能不具有重要意义。
　　3、比较两种来源不同的AngⅡ受体阻断剂对PFIB急性吸入性肺损伤的防治效果:采用大样本量的小鼠为实验对象,观察国产和进口两种不同来源的氯沙坦对小鼠全身暴露吸入PFIB染毒后24h肺系数和72h死亡率的影响,实验结果表明染毒对照组和各个时间给药组(染毒前0.5h、染毒后0.5h和染毒后1h给药40mg/kg)比较均无显著性差异。这说明国产和进口来源的氯沙坦对小鼠PFIB急性吸入性肺损伤均无明显的防治作用。结果提示,AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中病理学意义有限。
　　综合分析,大鼠PFIB急性吸入性肺损伤过程中肺组织AngⅡ及其调节酶ACE与肺损伤程度无明显的时间相关性。时间-效应和剂量-效应关系研究揭示AT1-R阻断剂氯沙坦对大鼠PFIB急性肺损伤无明显影响。选择多个时间点腹腔注射两种不同来源的氯沙坦对小鼠PFIB急性吸入性肺损伤均无明显的改善作用。结果表明,AngⅡ在PFIB急性吸入性肺损伤中的病理作用微弱,RAS在PFIB急性肺损伤的发生、发展过程中可能不发挥主要作用,PFIB通过AngⅡ激活NF-κB启动炎症级联的通路可能并不存在。以上结果可能与不同ALI模型对RAS的影响不同有关,也可能与RAS复杂的生物学作用有关,其具体机理有待进一步研究。
　　二、PFIB对PMVEC功能的影响
　　肺气血屏障(blood-gas barrier)的结构和功能受损在各种原因所致ALI中居中心地位。其中,肺毛细血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC)作为各种致病因素作用的靶细胞首先受到攻击,也是PMN扣押和游出血管时首先接触的细胞,所以PMVEC在ALI时的结构和功能变化受到越来越多的学者关注。
　　研究表明,肺损伤时气血屏障的细胞连接破坏、细胞骨架重排是炎性细胞渗出的关键环节,结果导致液体、蛋白、炎性介质等进入肺泡,这些构成了ALI的主要病理基础。PFIB染毒除了引起肺气血屏障主要细胞的结构发生病理改变,还影响细胞的分泌功能。一般情况下,血管内皮细胞受到炎症刺激时其胞内转录因子NF-κB被激活,促使多种炎性介质mRNA表达,进而诱发合成并释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),同时诱导细胞间粘附分子-1(intercellular adhension molecular-1,ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、E-选择素等粘附分子的表达,促进PMN趋化和聚集,分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)如基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)等降解基底膜、破坏正常肺泡结构,并引发更多的炎性细胞聚集和活化。
　　本课题的研究目的是,拟在前期PFIB染毒对肺气血屏障形态学研究的基础上,观察体外培养的PMVEC经PFIB染毒后分泌功能的变化特点,重点观察细胞因子(TNF-α、IL-1β)、粘附分子(ICAM-1)和基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的表达情况,探讨PMVEC在PFIB急性吸入性肺损伤过程中形态结构改变与功能变化的关联性,以丰富对PFIB染毒后气血屏障结构和功能的变化规律及PFIB急性吸入性肺损伤发病机制的认识,为更有效和针对性地防治PFIB急性吸入性肺损伤提供重要依据。
　　实验结果如下:
　　①PFIB刺激PMVEC染毒后0.5h即迅速合成大量TNF-α,至2h达峰值。PMVEC合成大量TNF-α的同时缓慢释放到细胞外,至染毒后4h培养上清液中TNF-α含量才达峰值。
　　②PFIB染毒后2h内刺激PMVEC合成大量的IL-1β,至2h达峰值,2h后伴随着PMVEC细胞凋亡数的增多合成的IL-1β也慢慢减少,但合成的IL-1β始终未释放到细胞外。
　　③PFIB染毒后迅速促进PMVEC大量合成ICAM-1,但始终未有ICAM-1大量释放到细胞外。
　　④染毒后PMVEC的培养上清液中MMP-2含量渐升高,至染毒后2h显著性增高,然后渐降低。PFIB染毒刺激PMVEC培养上清液中MMP-2迅速表达生物学活性。
　　⑤PFIB染毒并未刺激PMVEC生成和释放大量MMP-9,提示PFIB急性吸入性肺损伤时PMVEC可能不是MMP-9的主要来源。
　　综合前期研究结果分析,一方面PFIB染毒促进PMVEC大量凋亡,使肺气血屏障的完整性遭到破坏;另一方面刺激存活的PMVEC合成并释放大量TNF-α,表达ICAM-1。在上述因子与其它因素的综合作用下,PMN激活并粘附于PMVEC,释放活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)与蛋白酶类,对PMVEC及其基底膜造成进一步损伤。此外,PFIB染毒刺激PMVEC迅速释放大量MMP-2,后者可加速肺泡微血管内皮细胞连接的破坏、细胞骨架的重排,并破坏细胞外基质。以上因素综合作用的结果是肺气血屏障完整性受到破坏,失去对大分子的屏障作用,血浆蛋白漏出形成渗透梯度,血浆水分也随之进入血管外造成水肿,炎症介质等进入肺泡内,这些也是ALI主要的病理基础。

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前言

1、PFIB急性吸入性肺损伤的机制研究进展

二、肾素-血管紧张素系统与急性肺损伤的关系：

三、肺气血屏障受PFIB染毒刺激后结构和功能的变化：

第一章 内源性血管紧张素II在PFIB急性吸入性肺损伤中的作用研究

引 言

第一节 大鼠PFIB急性吸入性肺损伤时AngⅡ及相关酶类的变化规律

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第二节 AngⅡ1型受体阻断剂对大鼠PFIB急性吸入性肺损伤的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第三节 两种AngII1型受体阻断剂对小鼠PFIB急性吸入性肺损伤的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3.讨论

第二章 PFIB对PMVEC功能的影响

引 言

第一节 PFIB染毒对PMVEC表达ICAM-1、TNF-α和IL-1β等的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第二节 PFIB染毒对PMVEC表达MMP-2、MMP-9蛋白含量和活力的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

总讨论

参考文献

综述

在学期间发表论文

个人简历

致谢