反式HDV核酶重组载体的筛选及特异性研究

摘要

研究背景： 我国是肝炎大国，全国约有1.2亿HBsAg的携带者。乙型肝炎病毒感染，不仅能引起急、慢性肝炎，还与肝硬化和原发性肝癌的发生、发展关系密切。目前乙肝临床药物主要是核苷类衍生物以及干扰素等，核苷类衍生物包括拉米夫定，泛昔洛韦等。虽然它们在一定程度上能预防乙肝病毒的复制，但目前尚没有能根除HBV感染的特异有效的治疗方法。 核酶(ribozyme)是一类具有生物催化活性的RNA分子，可特异性结合并切割靶RNA，从而达到有效阻断基因表达的目的。目前发现的核酶有七种，包括锤头状核酶、发卡状核酶、HDV核酶、VS核酶、RNaseP和Ⅰ类及Ⅱ类内含子核酶。 HDV是目前发现的唯一一种在人类细胞内具有天然核酶活性的病毒，是由1.7kb组成的缺陷型负链RNA病毒，呈环状。其在细胞内的复制是通过滚环机制，由宿主细胞RNA聚合酶Ⅱ参与的RNA指导的RNA复制，产生线状基因组和反基因组，由核酶将长的转录物剪切成单位长度的RNA。作为HBV的微卫星病毒，病毒核心需要乙肝病毒(HBV)的HBsAg进行包装，才能形成具有感染活性的成熟病毒颗粒。所以HDV总是伴随HBV感染，否则HDV的感染就是一个自限性的过程而不能形成慢性感染。因此HDV核酶应该更适应人类细胞内的环境，而具有较高的核酶活性。HDV核酶较锤头状和发夹状核酶结构复杂，呈多个茎环组成的假结样结构，因而可能更具有稳定性。 由于HDV与HBV的特殊关系，使得HDV核酶用于HBV的治疗成为可能，本课题将就HDV核酶抑制HBV基因表达的特异性进行研究。通过在HBV全基因组保守区内设计针对于各个区域的潜在反式HDV核酶靶位点，以针对于HCV的反式HDV核酶靶位作为实验对照，筛选出高特异性和高抑制率的反式HDV核酶靶位。同时通过延长靶位长度，观察长度增加是否能增加HDV核酶抑制靶基因表达的特异性。将筛选出高特异性和高抑制率的HDV核酶靶位重组入逆转录病毒载体中，为进一步研究重组逆转录病毒载体抑制HBV表达的研究奠定基础。 研究方法： 1.反式HDV核酶靶位的筛选：通过HBV全基因组序列比对分析，筛选出HBV基因保守区，同时结合HDV核酶设计原则及参考文献，设计针对HBV各个基因区的5个反式HDV核酶靶位，同时设计有针对HCV的反式HDV核酶靶位点作为核酶特异性对照，PUC-U6作为载体对照。 2.反式HDV核酶重组载体的构建：通过基因重组方法构建针对HBV和HCV靶位的反式HDV核酶，利用PCR、酶切及部分测序等方法鉴定。 3.利用正交设计方法在96孔板内优化细胞转染条件，各个因素设4个梯度。其中细胞密度梯度为0.6×105-4.8×105/mL，质粒梯度为32-500ng，脂质体梯度为0.25-1.5μL。 4.反式HDV核酶靶位点的筛选：利用优化的细胞转染条件，将反式HDV核酶重组载体转染至HepG2215细胞，48小时后经ELISA方法分析细胞培养上清中HBV的HBsAg和HBeAg的表达结果；Western-Blot检测细胞中HBV的HBsAg、HBcAg的表达结果并进行数据分析，筛选出高特异性和高抑制率的反式HDV核酶靶位点。 5.反式HDV核酶的特异性分析：如果构建的反式HDV核酶重组载体抑制效率低，与对照组相比没有特异性，则选择部分反式HDV核酶将靶位结合区域由7bp延伸至12bp，利用ELISA、Western-Blot等方法检测靶位延长前后反式HDV核酶重组载体抑制HBV基因表达的变化。 6.MTT法鉴定反式HDV核酶对细胞生长的影响和毒性作用。细胞密度设为0.9×105-7.2×105/mL等四个梯度，经生长曲线分析选取合适的细胞密度，针对于HBVP、C、X、Pres1、Pres2区靶位的反式HDV核酶重组载体以及HCV和U6、脂质体对照组转染入HepG2215细胞48小时后测定OD值并进行活细胞计数，观察对细胞的毒害作用。 7.通过基因重组方法构建高特异性靶位核酶的重组逆转录病毒载体，转染HepG2215细胞24小时后检测载体的转染效率，为后续实验奠定基础。 研究结果： 1.筛选出了5个分别针对于HBV基因组的P、C、X、Pres1、Pres2区的反式HDV核酶作用靶位，其序列分别为CTGAGCC、TAGGCCT、CACAGAC、GAAGTCC与GGTTTAC。针对于HCV的反式HDV核酶靶位源于核心区，序列为CCGCATG。 2.筛选出的反式HDV核酶作用靶位经化学合成后重组入PUC19-U6载体，形成重组载体PUC-U6-P-Rz、PUC-U6-C-Rz、PUC-U6-X-Rz、PUC-U6-PreS1-Rz、PUC-U6-PreS2-Rz以及PUC-U6-HCV-Rz重组核酶载体对照。 3.利用PUC-U6-PreS2-Rz载体进行转染条件的优化，以PUC-U6作为质粒对照，采用ELISA方法测定细胞中HBsAg的表达情况，优化出了HepG2215细胞96孔板的最佳转染条件：细胞浓度1.2×105/ml，质粒量为200ng，脂质体用量为1μl。 4.重组载体PUC-U6-P-Rz、PUC-U6-C-Rz、PUC-U6-X-Rz、PUC-U6-PreS1-Rz、PUC-U6-PreS2-Rz以及PUC-U6-HCV-Rz、PUC-U6对照转染入HepG2215细胞，细胞培养上清中HBsAg的ELISA测定表明PreS2区、C区靶位的HBsAg抑制效率达到68％和60％，与HCV、U6对照组(23％、16％)比较有显著性差异。而PreS1区、X区、P区靶位反式HDV核酶抑制率为38％，18％和28％，与HCV和U6对照组之间比较没有显著性差异。ANOVA分析表明PreS2与C区靶位核酶的P/N值明显高于其他转染组；各实验组及对照组与空白组之间比较都有显著性差异(P＜0.05)；PreS2与C区之间、PreS1区与U6对照组之间、X区与HCV靶位之间均没有显著性差异(P＞0.05)，其余各组之间两两比较均有显著性差异(P＜0.05)。 与表面抗原的表达相反，E抗原的表达呈升高趋势。针对于靶位PreS2、C、P、X、Pres1的重组载体对HBeAg的增高率分别为65％，60％，100％，90％，92％；HCV和U6对照组对HBeAg的增高率分别为75％、110％。ANOVA分析表明各实验组及对照组与空白组之间比较都有显著性差异(P＜0.05)；PreS2与C区、HCV组之间，PreS1与X、P区以及HCV之间，P区与U6对照组之间均没有显著性差异(P＞0.05)。 Western-Blot结果证实各种反式HDV核酶处理后的细胞均能够产生特异性HBcAg，HBsAg的条带，应用Totallab2.1软件进行灰度分析结果表明针对PreS2与C区两个转染组HBsAg，HBcAg的表达量明显较其它组的表达量低。HBsAg，HBcAg的表达趋势与HBsAg的ELISA的结果一致。 5.延长PreS2、X区靶位长度从7bp至12bp。ELISA结果表明PreS2靶位在延长前后HbsAg的抑制效率分别为56.3％和55.8％；而X靶位在延长前后HBsAg的抑制效率分别为42％和36％。ANOVA分析表明PreS2靶位在延长前后对HBsAg的抑制效率没有显著性差异(p=0.208)；而X区靶位则存在显著性差异(p=0.000)。 与表面抗原的表达相反，E抗原的表达呈升高趋势。PreS2区靶位在延长前后对HBeAg的增高率分别为87％和79％，X区靶位在延长前后对HBeAg的增高率分别为98％和102％。ANOVA分析结果与HBsAg的结果一致。Western-Blot分析表明HBV表面抗原和核心抗原在PreS2区靶位延长前后灰度值基本相当，而X区靶位在延长前要比延长后灰度值高。该结果与ELISA结果一致。 6.MTT法检测结果表明在0.9×105-3.6×105/ml之间，细胞生长呈线性，随着细胞密度从3.6×105/ml加大到7.2×105/ml，细胞生长无明显变化，达到平台期。选取细胞浓度1.8×105/ml进行转染，结果表明空白组OD值为1.2，而实验组和各对照组的OD值均维持在0.3-0.4之间。单因素T检验结果表明空白对照组与其它各组之间相比有显著性差异(P=0.000)，脂质体对照组与其它载体组相比亦有显著性差异(P=0.001)。活细胞计数的统计学分析结果与OD值结果一致。 7.逆转录病毒重组载体PLEGFP-U6-Pres2-Rz转染HepG2215细胞，其转染效率能达到50％。 结论： 应用ELISA和Western-blot等方法成功的筛选出了2种高抑制率和高特异性的反式HDV核酶载体；将筛选出的核酶序列构建入逆转录病毒载体并成功表达；单纯的增加核酶靶位结合序列并不能相应的提高核酶的切割特异性。

目录

研究生导师和课题指导老师介绍

学位论文独创性声明及知识产权权属声明

摘要

主要符号表

前言

第一部分反式HDV核酶重组载体的筛选

第二部分反式HDV核酶重组载体抑制HBV基因表达的特异性研究

第三部分反式HDV核酶逆转录病毒载体的构建

小结

参考文献

附录

综述核酸抑制乙型肝炎病毒的研究进展

在学期间已(待)发表的文章

致谢