抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鉴定及蛋白稳定性调控研究

摘要

第一部分抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鉴定及蛋白稳定性调控研究
　　PTEN蛋白剂量水平的精细变化就与肿瘤的发生发展密切相关。与传统的抑癌因子不同，PTEN的功能发挥是连续性的，也就是说PTEN的抑癌功能并不依赖基因拷贝数的改变而出现跳跃式变化。研究发现当小鼠体内PTEN水平维持在80％时，乳腺癌的发生率就高达40％，因此PTEN蛋白的稳定性调控至关重要。既然PTEN的蛋白水平的精细变化就与肿瘤的发生发展密切相关，那么机体一定存在一套严格的监管系统来维持PTEN的蛋白稳定性。与抑癌蛋白p53不同，p53在细胞内的蛋白水平低，半衰期短，而PTEN则具有相对较长的半衰期和较高的内源表达水平。那么一个重要科学问题就是在生物体内PTEN的强稳定性如何被维持呢？蛋白质的翻译后修饰是维持蛋白稳定性的主要途径。其中泛素-蛋白酶体途径是生物体内最主要的蛋白质水平调控途径，泛素连接酶与去泛素化酶共同调控蛋白稳定性的平衡。目前报道的PTEN泛素连接酶共有5个，Nedd4-1，WWP2，XIAP，CHIP和TRIM27。
　　许多蛋白的泛素化修饰都可以被去泛素化酶(deubiquitinase，DUB)所逆转。人类基因组中大约有90个DUB分子。然而，对PTEN的去泛素化修饰还知之甚少。2008年Nature杂志报道位于细胞核的HAUSP可以去除PTEN的单泛素化修饰从而介导PTEN从细胞核转移到细胞质中。但是HAUSP对PTEN的蛋白稳定性却没有影响。因此在研究工作开展时，能够特异去除PTEN的多聚泛素化维持其蛋白稳定性的DUB分子仍未被鉴定到。本课题的研究目的就是鉴定能够去除PTEN多聚泛素化促进PTEN稳定的DUB分子，同时研究其生理病理功能。
　　针对鉴定能促进PTEN稳定的DUB分子这一科学问题，通过对全部人源DUB家族成员进行无偏向性筛选，发现OTU亚家族中的OTUD3(OTUdomain-containing protein3)分子可以显著地上调PTEN的蛋白水平。OTUD3定位于人类染色体1p36.13，是一个迄今为止研究极少的基因。通过研究目前获得的主要数据有:
　　(1) OTUD3作为PTEN的去泛素化酶调控PTEN的蛋白稳定性。OTUD3主要定位于细胞质中，N端的OTU结构域直接参与PTEN的C2结构域的结合，通过去除PTEN的多聚泛素化修饰、拮抗PTEN的泛素蛋白酶体降解，从而稳定PTEN的蛋白水平。敲低细胞内源OTUD3的表达，PTEN的蛋白稳定性显著下降，Akt通路被过度激活;在细胞中过表达野生型OTUD3，PTEN的半衰期延长，PI3K-Akt通路受到抑制。
　　(2) OTUD3的功能。首先，裸鼠成瘤实验表明在乳腺癌细胞系中过表达野生型OTUD3而非酶活突变型C76A可以抑制肿瘤的形成。相反，在乳腺癌细胞系中敲低内源OTUD3的表达可以促进肿瘤细胞的转移。而在正常乳腺上皮细胞中敲低内源OTUD3的表达会使细胞发生转化，在裸鼠皮下注射该细胞可形成肿瘤。
　　其次，在结肠癌细胞系HCT116、肺癌细胞系HepG2以及子宫颈癌细胞系HeLa中敲低内源OTUD3的表达，会促进肿瘤的形成并且会促进肿瘤的肝或者肺转移，这说明OTUD3的抑癌功能并不仅仅局限于乳腺癌。
　　最后，成功构建了OTUD3的转基因小鼠模型以及基因敲除小鼠模型。结果发现在OTUD3转基因小鼠的多种组织器官以及MEF细胞中PTEN都呈高表达，PTEN的稳定性增强，泛素化水平显著降低，Akt通路受到抑制，而基因敲除小鼠的表型与之相反。MMTV-PyMT转基因小鼠可以自发形成乳腺癌，是常用于乳腺癌研究的小鼠模型，为了在体内研究OTUD3的抑癌功能，将OTUD3转基因小鼠与MMTV-PyMT转基因小鼠交配。结果显示OTUD3转基因小鼠对MMTV-PyMT诱导的乳腺癌发生表现出显著的抑制效应。这从遗传学上充分证明OTUD3是PTEN的一个重要的稳定调控因子，在体内OTUD3发挥着重要的抑癌功能。
　　(3) OTUD3与乳腺癌的关系。通过大规模临床乳腺癌病人样本检测发现，与癌旁组织相比，OTUD3在乳腺癌组织（PTEN基因的突变率低）中低表达，并且PTEN的蛋白水平与OTUD3的表达呈正相关性。且OTUD3的表达与病人的预后有明显相关性。OTUD3表达高，病人出现淋巴结转移的概率越小，生存期越长，预后越好。
　　同时在乳腺癌中OTUD3和PTEN存在基因突变，OTUD3的突变体丧失了对PTEN的去泛素化修饰能力，在正常乳腺上皮细胞中过表达OTUD3-E86K突变体也会促进肿瘤的形成，说明E86K突变将OTUD3从一个抑癌基因转变为癌基因。这与抑癌因子PTEN和p53相似。而PTEN的突变体却丧失了与OTUD3的相互作用能力，从而失去了OTUD3的保护，结果导致PTEN蛋白的不稳定。
　　研究表明OTUD3分子是PTEN重要的正调控因子，OTUD3-PTEN通路在肿瘤的抑制过程中发挥着重要作用。总之，研究回答了PTEN领域中一个长期没有解决的重大问题，弥补了通过拮抗泛素化降解从而促进对PTEN稳定性调控这一机制长期未被解决的缺憾。OTUD3基因定位于人类染色体1p36.13，该区在乳腺癌中常发生缺失，同时该区与肿瘤的转移，预后差以及易复发等特性密切相关。通过研究发现OTUD3也是位于这一区域的一个重要的候选抑癌基因。
　　第二部分病毒蛋白PLP2依赖p53途径抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素通路
　　冠状病毒跟呼吸道、肠、肝脏、中枢神经系统疾病密切相关。然而直到二十世纪60年代，冠状病毒都没有被发现是引起人类疾病的病原体，直到2003SARS病毒在全世界的大爆发和蔓延，引起人类的大恐慌，冠状病毒才得到全球的关注。SARS冠状病毒在全球32个国家蔓延感染了8000多人，致死率高达10％。SARS疫情控制以后，科学家们加大了对冠状病毒的研究发现了另一支冠状病毒NL63。研究表明有7％的住院病人感染NL63，感染的小孩和大人常出现上呼吸道以及下呼吸道感染、支气管炎、以及结膜炎。但是很遗憾到目前为止还没有有效的抗病毒药物来治疗冠状病毒感染。
　　冠状病毒感染宿主细胞后，病毒RNA编码两类较大的融合蛋白pp1a和pp1ab，这些融合蛋白被病毒半胱氨酸蛋白酶(PLPs/PLpro/3 CLpro)切割成成熟的非结构性蛋白。NL63病毒编码两类半胱氨酸蛋白酶PLP1和PLP2来切割病毒复制酶，病毒复制酶常常在病毒感染24小时后就能被检测到。前期研究表明PLP2蛋白具有去泛素化酶活性，而且能抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素的表达。Ⅰ型干扰素能够很好的抑制冠状病毒的复制增殖，而且IFN-β的效果比IFN-α好。然而临床研究表明冠状病毒感染只会激发宿主细胞产生极低浓度的Ⅰ型干扰素，从而宿主细胞只能产生微弱的免疫应答导致导致病毒疯狂复制。但是这其中具体的调控机制到目前还不是很清楚。
　　自1979年P53基因被首次克隆鉴定起，科学家们就投入了大量的精力去探索P53基因的功能，并发现该基因在维持基因组的稳定性以及细胞周期和细胞凋亡调控中发挥着重要作用。但是，P53基因的功能

目录

声明

缩略语

第一部分 抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶鉴定及蛋白稳定性调控研究

摘要

前言

第一章 去泛素化酶OTUD3调控胞质PTEN的蛋白稳定性

1．研究背景

2．材料与方法

3．结果

4．小结

5．讨论

第二章 OTUD3的功能：抑制肿瘤的发生发展

1．研究背景

2．材料与方法

3．结果

4．小结

5．讨论

第三章 OTUD3在乳腺癌病人样本中低表达并存在基因突变

1．研究背景

2．材料与方法

3．结果

4．小结

5．讨论

总结

后记

参考文献

第二部分 病毒蛋白PLP2依赖p53途径抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素通路

摘要

研究背景

材料与方法

结果

小结

讨论

参考文献

附录1 综述 先天免疫的弄潮儿---IRF3／IRF7

附录2 在读期间已发表文章

附录3 个人简历

致谢