肾素(原)受体对小鼠视网膜新生血管作用的实验研究

摘要

第一部分、小鼠视网膜新生血管发生过程中肾素（原）受体的表达 目的： 观察高氧诱导小鼠视网膜新生血管发生过程中肾素（原）受体（（pro）renin receptor，PRR）的表达情况，阐明肾素（原）受体与小鼠视网膜新生血管生成的关系。 方法： 将180只新生C57BL_/6J小鼠分为两组：（1）正常对照组，正常氧环境中饲养；（2）高氧诱导组，小鼠生后第7天（postnatal day7，P7）起置入氧浓度为754±2％的氧箱中，至生后第12天时取出，制作小鼠视网膜新生血管动物模型。待出生后第12、13、17、21、30天时分别处死小鼠，通过视网膜血管灌注铺片、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot法，观察视网膜新生血管的分布与形态变化，并检测不同时间点全视网膜新生血管组织对PRR mRNA和蛋白质的表达水平的差异。应用免疫组织化学染色检测小鼠视网膜中PRR的表达部位。应用SPSS15．0统计学软件，采用两因素方差分析，分别比较高氧诱导组与正常对照组PRR mRNA和蛋白质表达水平的差异，以P<0．05作为差异有统计学意义。 结果： 视网膜灌注铺片显示高氧诱导组小鼠视网膜新生血管从生后第13天时开始生长，生后第17天达高峰，第21天开始消退，第30天时已基本消退。RT-PCR检测结果显示高氧诱导组和正常对照组的PRR mRNA表达水平差异有统计学意义（F＝43．324，P=0．000），各时间点间的PRR表达差异有统计学意义（F＝14．071，P=0．000）。Western Blot法检测结果显示高氧诱导组和正常对照组的PRR蛋白质水平差异有统计学意义（F＝20．235，P=0．000），各时间点间的PRR表达差异有统计学意义（F＝12．236，P=0．000）。高氧诱导组小鼠视网膜PRR的表达水平呈先升高后下降的趋势，于新生血管生长最多的17天达高峰，第13、17、21天的PRR mRNA水平显著高于正常对照组（P<0．05），第17、21、30天的PRR蛋白质水平显著高于正常对照组（P<0．05），其表达变化与视网膜新生血管的发生、发展及严重程度相关。正常对照组小鼠视网膜PRR在较低水平稳定表达。免疫组织化学染色结果显示PRR表达于视网膜微血管壁。 结论： PRR表达与小鼠视网膜新生血管的发生发展有明显的相关性，PRR表达上调可能是导致视网膜新生血管发生的关键因素之一。 第二部分、肾素（原）受体小干扰RNA对小鼠视网膜新生血管抑制作用的 实验研究 目的： 观察肾素（原）受体小干扰RNA对小鼠视网膜新生血管的抑制作用，并探讨其作用机制，进一步明确肾素（原）受体在小鼠视网膜新生血管发生过程中的作用。 方法： 将72只新生C57BL/6J小鼠随机分为6组：A组～E组建立高氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型，其中A组～D组分别给予PRR siRNA质粒、对照质粒、PRR siRNA质粒联合氯沙坦和氯沙坦治疗，E组不予任何治疗（OIR对照组），F组为空白对照组。各组分别于生后第17天处死小鼠，用视网膜灌注铺片、视网膜切片HE染色方法观察小鼠视网膜新生血管生长情况。用Western Blot方法检测各组小鼠视网膜中PRR的表达情况及细胞外调节蛋白激酶1，2（extracellular regulated protein kinases1，2，ERK1/2）的活化情况。用Real time PCR方法检测A、 B、E、F组小鼠视网膜中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表达。应用SPSS15．0统计学软件，采用单因素方差分析（LSD法），比较各组视网膜新生血管生长的差异以及PRR蛋白质表达水平、ERK1/2活化率和TGF-β1mRNA表达的差异，以P<0．05作为差异有统计学意义。 结果： 视网膜灌注铺片显示PRR siRNA治疗组、联合治疗组和氯沙坦治疗组视网膜血管清晰，走行较为自然，偶见血管渗漏，新生血管芽较OIR对照组和对照质粒治疗组明显减少。 视网膜切片HE染色显示PRR siRNA治疗组、联合治疗组和氯沙坦治疗组突破内界膜的血管内皮细胞数明显少于OIR对照组（P<0．05）和对照质粒治疗组（P<0．05）。 Western Blot结果显示OIR对照组小鼠出生后17天时视网膜PRR蛋白质表达水甲明显高于正常对照组（P=0．007）；给予PRR siRNA或联合氯沙坦治疗后，视网膜PRR蛋白质表达水半明显低于OIR对照组（P<0．05），而对照质粒治疗组和氯沙坦治疗组小鼠视网膜PRR蛋白质表达水平与OIR对照组相比无明显差异（P>0．05）。OIR对照组小鼠出生后17天时视网膜中活化的ERK1/2水平明显高于正常对照组（P=0．003）；给予PRR siRNA、氯沙坦或联合治疗后，ERK1/2的活化率均明显低于高氧诱导组（P<0．05）：其中PRR siRNA治疗组和联合治疗组降低更明显，与氯沙坦治疗组相比差异有统计学意义（P<0．05）。 Real Time PCR结果显示OIR对照组小鼠视网膜TGF－β1 mRNA表达水平明显高于正常对照组（P=0．001），给予PRR siRNA治疗后其表达水甲明显降低（P=0．004），而对照质粒治疗组与OIR对照组相比没有明显差异（P=0．222）。 结论： PRR与肾素或肾素原结合后可激活细胞内ERK1/2信号转导通路，促进细胞的增殖、分化和迁移，从而促进视网膜新生血管的生长。PRR小干扰RNA可明显降低视网膜中PRR的表达量，减少细胞内ERK1/2信号转导通路的激活，减少视网膜新生血管的生成，达到治疗视网膜新生血管的目的。

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引言

第一部分 小鼠视网膜新生血管发生过程中肾素(原)受体的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 肾素(原)受体小干扰RNA对小鼠视网膜新生血管抑制作用的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 肾素原和肾素(原)受体在眼部的病理作用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢