Ezrin的重组表达及其在胰腺癌血清检测、蛋白相互作用中的应用研究

摘要

胰腺癌恶性程度很高，常较早发生转移，同时对绝大多数化疗药物不敏感，使胰腺癌的治疗极为困难。肿瘤标记物是肿瘤早期诊断的有效工具，当前唯一应用的胰腺癌标志物是CA19-9，但其特异性不好。因此，迫切需要灵敏度和特异性更好的标志物用于胰腺癌诊断。 Ezrin是在各种肿瘤组织中表达均升高的蛋白，本实验室通过蛋白质组学技术也验证了其在胰腺癌组织中的高表达，有望成为胰腺癌或广谱肿瘤标记物。但是，一个具有临床应用价值的生物标志物应能够方便地在血清、尿液和唾液等易获得的体液中检测到。经过生物信息学预测，Ezrin可以Ⅲ型方式分泌，即通过分泌小泡、分泌小体的形式分泌到细胞外，有文献[1]也在肿瘤组织培养上清中检测到Ezrin的存在，所以Ezrin可能在肿瘤血清中存在。由于其表达水平的异常还可能刺激机体产生自身抗体，并且有研究[2]已经在获得性再生障碍性贫血病人血清中检测到了Moesin的自身抗体，所以，本研究拟以原核重组表达的Ezrin为基础，分别建立检测血清中Ezrin抗原和自身抗体的ELISA方法，判断两者是否可作为胰腺癌的标记物。 Ezrin蛋白结构中存在与多种蛋白结合的位点，Ezrin的高表达与肿瘤转移密切相关，并且近期的研究显示[3，4]，在肿瘤转移中是通过与其他蛋白形成复合物而行使作用的，所以了解更多的Ezrin相互作用蛋白对阐明其在肿瘤转移中的作用机制有重要作用。本研究拟筛选到更多的Ezrin相互作用蛋白，为阐明其在肿瘤转移中的作用机制奠定基础。 第一章、 Ezrin的重组表达及纯化 目的：构建含有Ezrin基因的表达载体，转染入大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，纯化。 方法：提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA，RT-PCR法扩增Ezrin基因。将扩增得到的Ezrin基因片段和pET15b质粒连接，获得pET15b-Ezrin重组质粒，转化E. coli DH5α，双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E. coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，以IPTG诱导表达，对表达产物进行Ni2+-NTA亲和层析和分子筛纯化后，行SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS/MS质谱分析和western-blot鉴定。 结果：RT-PCR扩增出的Ezrin基因片段（1761bp）与理论DNA表达片段大小一致，测序鉴定显示克隆的Ezrin基因序列与GenBank报道序列相符。SDS-PAGE、质谱分析显示纯化后Ezrin重组蛋白纯度较好，含有少量的降解片段，western-blot分析显示，Ezrin重组蛋白与兔抗Moesin多克隆抗体无交叉反应。 结论：成功构建了pET15b-Ezrin表达载体，在大肠杆菌中成功表达、纯化了Ezrin蛋白，经鉴定纯度较好。 第二章、胰腺癌血清中Ezrin抗原和自身抗体ELISA检测方法的建立 目的：检测Ezrin及自身抗体在胰腺癌、胰腺炎、正常人血清中的水平是否存在差异。 方法：构建单克隆抗体包板，多克隆抗体作为检测抗体的双抗体夹心ELISA方法，并用该方法同时对胰腺癌、胰腺炎、正常人血清中的Ezrin水平进行检测；以经纯化的原核重组表达的Ezrin蛋白作为抗原，建立间接ELISA的方法对胰腺癌、胰腺炎、正常人的血清标本中的Ezrin自身抗体水平进行检测；通过对数据的统计分析，判断Ezrin或其抗体是否是胰腺癌生物标志物。 结果：建立了双抗夹心ELISA方法，用该方法检测的11例胰腺癌、11例胰腺炎、12例正常人血清样本的数据均较小，与空白相差不大，三组数据没有显著性差异（one-way ANOVA，P>0.05）；建立了检测Ezrin自身抗体的间接ELISA方法，统计分析21例胰腺癌、21例胰腺炎、21例正常人的血清标本检测数据发现所有样本都有阳性结果，而且数据没有显著性差异（one-way ANOVA，P>0.05）。 结论：Ezrin在血清中微量存在，但不是胰腺癌特异的；另外，构建的双抗夹心ELISA方法没有达到所需的灵敏度，在下一步的研究中，还需对检测抗体进行生物素标记，放大信号；Ezrin抗体不是胰腺癌的特异标志物，是自然存在的自身抗体（Naturally occurring auto-antibodies，NAbs），对机体有不可或缺的生理作用。 第三章、Pulldown结合蛋白质组学方法发现Ezrin相互作用蛋白 目的：采用蛋白质组学方法筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。 方法：western-blot分析验证纯化的Ezrin重组蛋白上含有His标签。裂解Panc-1细胞，获得总蛋白提取液，采用Pull-down方法体外筛选与Ezrin重组蛋白相互作用的蛋白，并对筛选出的目的蛋白进行双向凝胶电泳和MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定，构建交联免疫沉淀方法，并用该方法对筛选的两种蛋白进行验证。 结果：双向凝胶电泳和质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的12种蛋白，其分别为RNA-binding motif protein39（RBM39）、Transgelin（TAGLN）、Albumin（ALBU）、Formin-1（FMN1）、Rho GTPases（RHGBA）、Tetratricopeptide repeat protein16（TTC16）、Syntaxin-binding protein1（STXBP1）、N-acetylglucosamine-1-phosphate transferase alpha（GNPTA）、myosin（MYH7）、cAMP-regulated phosphoprotein（ARPP19）、CA195、microcephalin1（MCPH1）；其中，几种蛋白与细胞的迁移有关，证明了该方法的可行性；成功构建了交联免疫沉淀方法，为后续验证蛋白相互作用奠定了基础。 结论：体外成功筛选出可能的与Ezrin蛋白相互作用的蛋白。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

前言

第一章Ezrin的重组表达及纯化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 目的基因Ezrin的扩增

2.2 重组表达载体的构建与鉴定

2.3 重组Ezrin蛋白的鉴定

3 讨论

4 小结

第二章胰腺癌血清中Ezrin抗原和自身抗体ELISA检测方法的建立

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 夹心ELISA检测血清样本中Ezrin

2.2 间接ELISA检测血清样本中Ezrin抗体

3 讨论

4 小结

第三章Pulldown结合蛋白质组学方法发现Ezrin相互作用蛋白

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 Western blot验证重组蛋白的His标签

2.2 一维电泳分离结果

2.3 双向电泳分离结果

2.4 免疫沉淀交联效果的免疫印迹验证结果

3 讨论

4 小结

参考文献

附录

综述ERM蛋白的生物学功能及其与肿瘤的联系

攻读硕士期间发表论文

致谢