重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵工艺研究

摘要

骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视,BMP-7是其中研究比较深入的一种。BMP-7具有较强的诱导成骨活性,目前FDA已批准BMP-7在美国多中心、大规模治疗胫骨骨不连的临床实验。随着临床研究的深入,人们需要大量高纯度、有活性的BMP-7,从骨中提取BMP-7虽活性高,但步骤繁琐且产量低,用基因工程技术获得纯度高、活性好的重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human Bonemorphogenetic protein,rhBMP-7)显的尤为迫切。国内外已有用昆虫和CHO细胞表达rhBMP-7的报道,虽然真核细胞生产的rhBMP-7具有较好的活性,但是同样具有产量低、价格高的缺点,因此本实验室将研究方向集中在用大肠杆菌表达系统表达rhBMP-7,以期获得成本低、纯度高、活性好的rhBMP-7。
　　 目的：
　　 本实验室对大肠杆菌表达rhBMP-7已经有较深入的研究,成功地构建了以包涵体形式表达rhBMP-7成熟肽的大肠杆菌表达系统,并对表达的rhBMP-7进行了分离纯化及活性的测定,然而原有rhBMP-7工程菌的发酵工艺存在产量低、培养基价格高以及表达不稳定等缺点,其产量湿重最高只有15g/L左右,不能满足大规模工业生产的需要,因此本实验在以往实验的基础上,参考其他工程菌的高密度发酵工艺,探索rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺,以期建立新的发酵工艺,用较低的成本获得大量的rhBMP-7,为大规模生产rbBMP-7打下基础。
　　 方法：
　　 1.将保存的工程菌的质粒提取出来并酶切验证,然后转化新的宿主菌E.coliBL21(DE3)。
　　 2.在摇瓶中每隔2h取样并测定菌体密度绘制工程菌在LB培养基和TB培养基中的生长曲线以确定工程菌在LB和TB培养基中的对数生长期、采用Plackett-Burman实验设计法优化发酵培养基以找出适合工程菌生长的培养基配方、通过往发酵培养基中加入不同浓度的乙酸钠以检测其对工程菌生长及rhBMP-7表达的影响、将工程菌接种于不同pH值的发酵培养基中培养以考察pH值对工程菌生长及rhBMP-7表达的影响。
　　 在发酵罐中采用补料分批发酵的方式探索诱导时间对rhBMP-7表达的影响、通过通入富氧空气以提高溶氧水平并考察溶氧水平对工程菌生长的影响、通过控制补料速率使发酵罐中葡萄糖浓度保持在较低水平以降低代谢负产物的产生,在优化后的条件下探索rhBMP-7工程菌的高密度发酵和高表达。
　　 3.提取工程菌表达的rhBMP-7包涵体,离子交换层析法纯化并用SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot检测。
　　 结果：
　　 1.保存的工程菌经SDS-PAGE分析rhBMP-7的表达量,而重新转化后的工程菌rhBMP-7的表达量可达32％。
　　 2.经摇瓶实验发现工程菌在LB培养基中的对数生长期为接种后4～6h,菌体密度在1.80～3.50(A600)之间;在TB培养基中的对数生长期为接种后10～14h菌体密度在4.10～6.40(A600)之间;Plackett-Burman实验设计法优化后的发酵培养基各种成分的浓度分别为磷酸二氢钾13.3g/L,磷酸氢二铵4g/L,柠檬酸3.4g/L,硫酸镁1.2g/L,维生素B14.5mg/L,微量元素20ml/L,葡萄糖15g/L;适于工程菌生长的pH值为6.8,比生长速率可达0.55h-1;适于目的蛋白表达的pH值为7.6,rhBMP-7的表达量可达菌体总蛋白的36.5％;在发酵罐中升温诱导3hrhBMP-7表达量可达34.6％;在通入富氧空气的条件下培养基溶氧水平可以保持在较高水平有利于工程菌的生长;将比生长速率控制在较低水平可以避免代谢负产物的大量产生;取TB培养基培养的对数期种子,10％接种于优化后的发酵培养基,控制溶氧在20％以上,诱导前调节发酵液pH在6.8～7.0之间,诱导后调节发酵液pH在7.4～7.6之间,经过20h的发酵,工程菌的菌体密度(A600)达到140左右,湿重可达200g/L,rhBMP-7的表达量达到30％以上。
　　 3.离子交换层析法纯化后rhBMP-7的纯度可达95％以上,经SDS-PAGE凝胶电泳和Western Blot检测,复性后的rhBMP-7二聚体比例可达40％并且能与抗体特异性结合。
　　 结论：
　　 经过探索研究,初步建立了rhBMP-7工程菌高密度发酵的工艺,该工艺最终菌体密度可达140(A600),菌体湿重可达200g/L,rhBMP-7的表达量达到30％以上,与文献报道的其他工程菌相当,该工艺基本能够满足工业化生产的需要。
　　 经过优化的最佳工艺流程为:以TB培养基中过夜培养的种子10％接种于发酵培养基中,30℃培养,调节转速或通入富氧空气控制溶氧水平在20％以上,诱导前调节发酵液pH在6.8～7.0之间,诱导后调节发酵液pH在7.4～7.6之间,当发酵罐内葡萄糖耗尽时补充补料培养基使工程菌的比生长速率保持0.12h-1,当发酵罐内的菌体浓度达到100(A600)时升温至42℃诱导,诱导后降低补料速率使得工程菌的比生长速率保持在0.1h-1,诱导3h后结束发酵,最终菌体密度可达菌体密度可达140(A600),菌体湿重可达200g/L,rhBMP-7的表达量达到30％。