LSECtin在HBV感染小鼠模型中的免疫功能研究

摘要

肝脏作为免疫器官，承担着耐受和免疫的双重功能。两者间的精妙平衡依赖于肝内定居的各种免疫细胞和外周白细胞之间的复杂相互作用网络。长期以来，尽管肝脏免疫耐受（肝移植）和免疫低反应性（病毒慢性感染）早已被公认，但具体的机制还很不清楚。该属性使得肝脏成为病原体的靶器官，一些病原体如HBV则逃脱免疫控制而在肝细胞长期存在。
　　HBV是嗜肝性DNA病毒。HBV感染导致慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌，是威胁到人类健康的世界性卫生问题。就病毒本身而言，对肝细胞并无直接的病变作用。其对肝脏的巨大损伤来之病毒慢性感染诱导的免疫反应，由早期的应答不充分到中期的衰竭及后期的免疫紊乱。因此，机体针对病毒的免疫反应被认为是引起肝脏疾病的重要原因。而同时机体针对病毒的免疫反应也完全介导了病毒的清除。免疫反应的双刃剑角色，让我们干预处理慢性感染时，寻找合适的平衡点，就显得尤为重要。
　　HBV感染后，积极有效的清除病毒，依赖于天然免疫和继发免疫的共同调节作用。在CD4+T细胞的辅助下，CD8+T细胞通过细胞毒和非细胞毒机制，清除感染的靶细胞。因此，CD8+T细胞的功能和状态在决定病毒感染的进程上起着决定性的作用。很遗憾的是，慢性感染时，CD8+T细胞常常处于衰竭状态。当前的研究发现了多种与之相关免疫信号转导通路。包括细胞膜表面高表达以PD-1为代表的多种抑制性受体，这些负调控分子限制了T细胞抗病毒效应;其次，在微环境下，其它细胞分泌的调节性因子，如IL-10，TGF-β调节和抑制抗病毒免疫反应;第三，调节性细胞，如FoxP3+的天然和诱导的调节性细胞(Tregs)、调节性CD8+T细胞和髓来源抑制细胞，以cell-to-cell的接触方式，抑制APC的成熟、分泌调节性细胞因子和直接减弱T细胞的功能;最后，职业和非职业抗原递呈细胞的改变给予T细胞的不适当刺激信号。由细胞和分子构成的综合体系，编织了一套复杂的抑制性网络，抑制CD8+T细胞的抗病毒功能，从而促进病毒的持续性感染。
　　当前，治疗乙肝，日益被国际认可的趋势是:双管齐下，联合治疗。既要抗病毒，又要调免疫。仅抑制病毒复制无法恢复受损的免疫系统。降低病毒载量，提升免疫能力，打破免疫耐受，以恢复患者的抗病毒免疫应答，最终达到持久清除病毒、恢复机体保护性免疫。目前免疫调节药物有DC疫苗疗法，CIK细胞疗法和免疫负调节分子（PD-1，IL-10，LAG-3，TIM-3等）阻断法。HBV特异性T细胞功能受损是机体无法清除病原体的关键原因之一，而免疫负调节分子又是促使T细胞功能衰竭的关键因素，因此以T细胞免疫负调节分子为靶标，封闭其抑制功能从而恢复T细胞的免疫反应，尤其是起关键效应功能的CD8+T细胞，重获抗病毒能力。
　　LSECtin是Ⅱ型跨膜糖蛋白，位于人类染色体19p13.3，是C型凝集素家族的新成员，该家族成员包括CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR。LSECtin结合Ebola病毒，SARS冠状病毒，纤丝病毒，Lassa病毒，促进细胞对日本脑炎病毒的易感性。我们实验室的前期研究结果表明LSECtin以Ca2+依赖的方式，结合活化的T细胞表面的N-链接的糖蛋白，抑制T细胞的增殖，降低T细胞分泌IFN-γ，IL-2的水平，从而负调节T细胞的免疫应答。这促使我们想知道LSECtin在HBV感染时的免疫调节功能。
　　我们计划构建HBV急性感染，慢性感染小鼠模型。在模型小鼠里，我们通过过表达LSECtin蛋白和敲除LSECtin，以及封闭LSECtin等手段，多层次多角度探索LSECtin在HBV感染时的免疫功能。
　　由于HBV感染宿主的偏嗜性:人和猩猩，以及HBV转基因小鼠的天生中枢耐受，长期以来限制了在小动物模型上研究HBV导致的免疫反应。直到近年来， Francis V.Chisari团队和台湾陈培哲团队分别首次建立了HBV急性感染和慢性感染小鼠模型。为研究HBV提供了强有力的工具。我们尝试建立该模型，通过剂量优化，检测体系和评价体系摸索，我们成功的建立了HBV急性感染的小鼠模型，可持续2周左右;同时，我们还建立抗原持续时间更长一些的急性感染模型，抗原的持续时间可达1个月。最后，我们建立了慢性感染模型，满一年后，仍有1/3的小鼠，表面抗原为阳性。
　　首先，我们在Balb/c背景的LSECtin敲除小鼠里建立两种急性模型，缺失LSECtin后，血清中表面抗原和E抗原的水平更低，肝细胞中核心抗原下降，表面抗原的阳性率更低。反之，我们利用质粒在小鼠体内过表达LSECtin，则延缓病毒抗原清除。在C57BL/6背景的慢性模型中，敲除LSECtin，加速抗原的清除，小鼠有更低的表面抗原阳性率，这和急性模型的表型一致。总之，LSECtin可以延缓病毒抗原的清除，动物表型提示LSECtin可能是病毒持续感染的“帮凶”。
　　LSECtin是通过什么机制延缓病毒抗原清除的呢？LSECtin作为继发免疫的负调控分子，减弱继发免疫反应，结合活化的T细胞，抑制T细胞的增殖，降低T细胞分泌IFN-γ和IL-2的水平。而CD8+T细胞在决定病毒感染的发生发展有至关重要的作用。于是，我们探讨LSECtin是否抑制了CD8+T细胞的抗病毒功能。建模后，比较WT和KO小鼠肝脏淋巴细胞中CD8+T细胞的表型，我们发现，缺失LSECtin后，CD8+T细胞呈现CD25high CD62LlowCD127low的表型，而这群细胞正是发挥抗病毒效应的细胞。提示LSECtin可能抑制CD8+T细胞的活化及效应。进一步的ELISpot实验，也提示LSECtin抑制病毒特异性T细胞分泌IFN-γ的能力，肝脏混合淋巴细胞中CD8+T细胞是分泌抗病毒关键因子IFN-γ的主要来源。总之，体内外实验，提示LSECtin可能通过降低表型为CD25high CD62LlowCD1271ow的CD8+T细胞群比例，抑制肝脏内淋巴细胞分泌效应因子IFN-γ的能力，从而导致延缓病毒抗原清除。
　　在表型确凿和机制上有初步探讨后，我们想在应用有所尝试。小分子化合物GlcNAcβ1-2Man是LSECtin的高亲和力配基。Ki值为3.5±0.4μM。近期研究发现，GlcNAcβ1-2Man可阻断LSECtin与Ebola病毒，Lassa病毒等病毒的相互结合，此外，该化合物还可封闭LSECtin对日本脑炎病毒的识别，降低细胞的易感性。但是，GlcNAcβ1-2Man在体内是否有封闭功能，国际上未有报道。我们建立HBV慢性感染小鼠模型，腹腔注射13μM的GlcNAcβ1-2Man，持续六周，令人吃惊的是，糖注射组比PBS组有更低的表面抗原和E抗原水平，表面抗原阳性率更低，暗示GlcNAcβ1-2Man可作为LSECtin的功能性阻断剂。
　　综上所述，LSECtin作为免疫负调控分子，抑制CD8+T细胞的抗病毒的功能，可能是病毒持续感染的“帮凶”。小鼠体内实验提示LSECtin的高亲和力配基GlcNAcβ1-2Man可封闭其抑制T细胞反应的功能，从而加速病毒抗原清除。综合提示LSECtin可能被作为潜在的靶分子，用来干预或治疗HBV。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 HBV感染小鼠模型的建立和评价

1．研究背景

2．材料

3．方法

4．结果

4．1 用pBluescript Ⅱ KS-1．3HBV质粒建立HBV急性感染小鼠模型

4．2 用pAAV／HBV1．2质粒建立HBV急性感染小鼠模型

4．3 用pAAV／HBV1．2质粒建立HBV慢性感染小鼠模型

5．小结

第三章 LSECtin在小鼠HBV感染模型中的功能

1．研究背景

2．材料

3．方法

4．结果

4．1 质粒pBS-HBV1．3急性HBV感染小鼠模型中，敲除LSECtin加速抗原清除

4．2 质粒pBS-HBV1．3急性HBV感染小鼠模型中，过表达LSECtin抑制抗原清除

4．3 质粒pAAV／HBV1．2急性HBV感染小鼠模型中，敲除LSECtin加速抗原清除

4．4 质粒pAAV／HBV1．2慢性HBV感染小鼠模型中，LSECtin抑制抗原清除

5．小结

第四章 探索LSECtin延缓HBV病毒抗原清除的机制

1．研究背景

2．材料

3．方法

4．结果

4．1 LSECtin延缓病毒抗原清除的机制

5．小结

第五章 尝试LSECtin在治疗HBV上的应用

1．研究背景

2．材料

3．方法

4．结果

4．1 阻断LSECtin的功能促使HBV病毒抗原清除加快

5．小结

讨论

总结

参考文献

附录：主要仪器设备及常用试剂

综述 B型病毒性肝炎的临床免疫学--天然免疫反应

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