肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

摘要

α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶，可以水解人们日常饮食中常见的黄酮苷类化合物，广泛分布于自然界的细菌和真菌中。Α-L-鼠李糖苷酶在实际工艺中具有很多潜在的应用价值。本论文选用Enterococcus durans作为发酵菌种，对α-L-鼠李糖苷酶的活性条件测定进行了研究，重点讨论了从发酵液中分离提纯得到α-L-鼠李糖苷酶的主要过程，并研究了纯化后的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质。主要实验结果如下：
　　 (1)确定了α-L-鼠李糖苷酶的活性测定条件：在10 mL的比色管中，加入2 mL pH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液后，再加入0.1 mL酶液或粗酶液，置于45 ℃水浴锅中预热5 min，加入0.2mL已经预热的对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷作为底物，反应4 min，反映结束后立即取出并加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3终止反应，冷却至室温后，于400 nm波长处测定吸光值。
　　 (2)通过单因素实验以及正交试验对Enterococcus durans 产α-L-鼠李糖苷酶的发酵条件进行了优化，得到基础产酶培养基的最佳配比为：蔗糖1.25％，大豆蛋白胨1.25％，磷酸二氢钾2 mmol/L，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，硫酸铁3 mmol/L；相应的产酶发酵条件为：培养基的初始pH为7.0，培养温度为34℃，发酵周期为4 d，摇床转速为180 r/min,250 mL三角瓶装液量为70 mL，接种量为3％。
　　 (3)α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化：
　　 ① 实验确定了硫酸铵分级沉淀浓度范围为50～80％；
　　 ② 硫酸铵盐析后的沉淀用20 mL 4℃蒸馏水溶解后，装入透析袋，置于4℃蒸馏水中透析约30h后，浓缩至5mL；
　　 ③ 采用DEAE-纤维素52阴离子交换层析纯化α-L-鼠李糖苷酶：采用平衡缓冲液的pH为5.0，KCl梯度线性化洗脱浓度为0.2～0.6 mol/L，在KCl浓度低于0.2 mol/L或高于0.6 mol/L时，基本没有蛋白峰洗出。洗脱流速为0.6 mL/min，15 min收集一管，发现收集的第12管中酶活最高，第一蛋白峰没有目的酶活性，为杂蛋白峰，KCl浓度为0.3～0.5 mol/L时，即可把α-L-鼠李糖苷酶洗脱下来。
　　 ④ 采用SephadeXG-100 凝胶过滤层析纯化α-L-鼠李糖苷酶：用pH5.0、浓度0.02 mol/L的醋酸缓冲液洗脱，流速为0.4 mL/min，15 min收集一管，得到三个蛋白峰，第三个为峰为目标峰。
　　 (4)对盐析后和凝胶层析纯化后的酶蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为6％。结果表明，盐析并透析后的酶液仍含有很多杂蛋白，经过离子交换层析和凝胶层析后，SDA-PAGE凝胶电泳显示单条带，表明酶蛋白已经得到纯化，并确定酶蛋白的分子量约为90 Kda。
　　 (5)纯化后的α-L-鼠李糖苷酶经酶学性质研究发现耐酸性较强并具有较强的耐热性；K+、Mg2+对α-L-鼠李糖苷酶具有明显的激活作用，而Ca2+、Fe2+则对酶具有显著的抑制作用。多数有机溶剂对α-L-鼠李糖苷酶均有一定程度的抑制作用，其中丙酮对α-L-鼠李糖苷酶的抑制作用最强。以对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷为底物的动力学常数为：Vmax﹦16.13 U/L，Km﹦4.58 mmol/L。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 绪 论

第2章 肠球菌产α-L-鼠李糖苷酶液体发酵培养基的优化

第3章 肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶的分离纯化

第4章 肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶的性质研究

第5章 结论与展望

参考文献

致 谢

在学期间主要科研成果